曾金金，趙瑋

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，山東 濰坊 261041；2.山東益生畜禽疾病研究院，山東 煙臺 265508)

沙門氏菌是一種嚴(yán)重危害人和動物的致病菌，對種雞危害巨大。其能定居于機(jī)體內(nèi)多個內(nèi)臟器官，通過生殖系統(tǒng)和糞便能夠垂直傳播和水平傳播。產(chǎn)蛋種雞感染沙門氏菌后引起死淘增加，飼料轉(zhuǎn)換率降低，生產(chǎn)性能下降，種蛋孵化水平下降；雛雞感染沙門氏菌后，死淘增加，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此，在實驗室進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定工作對生產(chǎn)現(xiàn)場具有非常重要的指導(dǎo)意義。本文就沙門氏菌的分離鑒定時的注意事項進(jìn)行總結(jié)如下。

1 樣品采集

1.1 病死雞的病料采集 病死雞一般取其肝臟、脾臟、卵巢、腸道；新生雛雞取其肝臟、卵黃，樣品采集要求無菌操作。

1.2 環(huán)境采樣

1.2.1 水樣的采集 采集點為養(yǎng)殖場的水源、雞舍水線（包括前端、后端），先將出水點周圍消毒，再用滅菌瓶接取水樣以免環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)入樣品中影響結(jié)果。

1.2.2 飼料的采集 不同點采集飼料，采樣總量為100g混勻，隨機(jī)采樣2份。

1.2.3 墊料或糞便、灰塵采樣 對于平養(yǎng)場區(qū)，在雞舍內(nèi)不同區(qū)域采取墊料、雞糞，在雞舍的前中后至少均勻取5個點，每個點取樣至少10g，混勻，不同雞舍或不同欄總采集5份，或者采樣時采樣者穿著一次性鞋套在雞舍內(nèi)走三圈，然后把鞋套底朝內(nèi)翻轉(zhuǎn)裝入封口袋待檢，不同雞舍或欄采集樣本5份?；\養(yǎng)場雞舍內(nèi)用同一棉簽蘸取多點，要求10點以上，采集樣本10份裝入封口袋待檢。

2 樣品的保存及運輸

樣品采集后若不能及時檢測，要放入4℃保存，樣品在運輸過程中要保證溫度。夏天避免溫度過高導(dǎo)致腐敗，冬天避免結(jié)冰。

3 增菌液的選擇

培養(yǎng)沙門氏菌的前增菌液有蛋白胨緩沖水、胰酶解酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基，選擇性肉湯培養(yǎng)基有亞硒酸鹽胱氨酸肉湯（SC）、氯化鎂孔雀綠、液體連四硫酸鹽等。由于前增菌液對沙門氏菌的選擇性不高，所以實際分離過程中可以將沙門氏菌選擇性肉湯作為增菌液進(jìn)行增菌，不同來源的樣品所攜帶的細(xì)菌種類不同，因此分離沙門氏菌時就要選擇不同的增菌液。由于硒對人體有毒性作用，所以SC現(xiàn)在使用較少。

3.1 病死雞病料的沙門氏菌分離。由于病死雞病料中所攜帶細(xì)菌種類較少，對增菌液的選擇性不高，SC、氯化鎂孔雀綠、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、液體連四硫酸鹽都可以對其進(jìn)行增菌，也可以取其肝臟、脾臟、卵巢直接劃線接種于鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。

3.2 肛拭子、糞便（包括雛雞胎糞）、腸內(nèi)容物、墊料、灰塵進(jìn)行沙門氏菌分離時一般選擇液體連四硫酸鹽增菌液進(jìn)行增菌，效果較好。

3.3 水、飼料、種蛋可以選擇SC、氯化鎂孔雀綠、液體連四硫酸鹽進(jìn)行增菌。

4 鑒別培養(yǎng)基的選擇

樣品增菌24h后，要劃線接種于鑒別培養(yǎng)基，沙門氏菌的鑒別培養(yǎng)基有SS瓊脂、木糖賴氨萜醇-4培養(yǎng)基（XLT4）、膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）、麥康凱、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、亮綠（BG）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基等等，沙門氏菌在不同培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)以及顏色不同，不同培養(yǎng)基對其他雜菌的抑制作用也不一樣，肝臟、脾臟、卵巢可以選擇普通營養(yǎng)瓊脂、SS、XLT4、膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）、麥康凱、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、煌綠、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基等，肛拭子、糞便（包括雛雞胎糞）、腸內(nèi)容物、墊料、灰塵增菌24h后選擇普通營養(yǎng)瓊脂、SS、XLT4、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基效果較好。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基在選擇性培養(yǎng)基中的效果要好于其他鑒別培養(yǎng)，但是價格較高，XLT4能有效抑制其他競爭微生物的生長，特別是變形桿菌的生長，所以在分離環(huán)境樣品中占有很大的優(yōu)勢。由于不同或同一細(xì)菌在不同鑒別培養(yǎng)基上的生長形態(tài)都不同，所以傳代于鑒別培養(yǎng)基時要選擇多種培養(yǎng)基以便于快速得到可疑菌落。沙門氏菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為：普通營養(yǎng)瓊脂上為無色半透明、邊緣整齊的圓形菌落；SS平板上沙門氏菌呈圓形、表面光滑、濕潤、中心黑色（有些菌株無黑色中心）、邊緣透明的菌落；DHL與SS平板上沙門氏菌菌落相似但黑色中心比SS平板上所形成的大一些；XLT4平板上沙門氏菌呈粉紅色、中間帶有金屬光澤的黑色中心、邊緣整齊的圓形菌落；XLD與XLT4平板上的沙門氏菌菌落相同；BG平板上沙門氏菌為紅色、邊緣整齊的圓形菌落；麥康凱上沙門氏菌為無色、中心略帶粉色、邊緣整齊的圓形菌落。

5 生化鑒定

生化鑒定要選擇沙門氏菌鑒定生化管，操作時要確保所檢測菌落為純化后的單一菌株。

6 單因子血清凝集

對分離的可疑菌落先進(jìn)行A-F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。被A-F多價 O 血清凝 集 者 ，依次用 O1、O2、O4、O5、O9、O12因子血清做凝集試驗根據(jù)試驗結(jié)果，判定O群。每一個O抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒有O單因子血清的要用兩個O復(fù)合因子血清進(jìn)行核對。不被A-F多價O血清凝集者，先用9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。屬于A-F各O群的常見菌型，H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。不常見的菌型，先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以第1相和第2相的H抗原。每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩個H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對，檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查，如仍只檢出一個相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個相單相菌不必做位相變異檢查。單因子血清凝集法能快速準(zhǔn)確的對沙門氏菌分型。

7 傳統(tǒng)檢測方法（國標(biāo)法）與PCR法

傳統(tǒng)的分離方法最終可得到沙門氏菌的純培養(yǎng)物，方法簡單、準(zhǔn)確、可重復(fù)性強(qiáng)，有一定的靈敏性，但檢驗程序復(fù)雜，耗時較長，一般4～7d。PCR靈敏性高、特異性好、操作簡單，出結(jié)果較快，但易出現(xiàn)假陽性，操作時首先要確保引物設(shè)計質(zhì)量，如果選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列，靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性，需要重新設(shè)計引物。熱裂解法提取DNA簡單、快捷較為常用，細(xì)菌DNA降解與煮沸時間存在一定的正相關(guān)性，獲得PCR的量于煮沸時間成正相關(guān)，在獲得同樣PCR效果的前提下，煮沸時間越短越好，以2min為宜。

以上闡述了沙門氏菌分離幾個環(huán)節(jié)所需的注意事項，但不能面面俱到，在實驗室操作過程中每一步都要求規(guī)范、仔細(xì)的操作，以得出準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。