徐新艷 趙水娣

銅綠假單胞菌是臨床感染常見(jiàn)病原菌之一，也是支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺氣腫、肺囊性纖維化等病變繼發(fā)感染的主要病原菌[1]。隨著抗生素的過(guò)度使用，導(dǎo)致臨床標(biāo)本中分離出的細(xì)菌菌落形態(tài)發(fā)生變異，給鑒定工作帶來(lái)困難。現(xiàn)和大家共同探討我院1例慢性阻塞性肺氣腫患者的痰標(biāo)本中分離的慢生長(zhǎng)黏液型銅綠假單胞菌的檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1一般資料 患者，男，63歲，于多年前就無(wú)明顯誘因出現(xiàn)咳嗽，咳少量白色泡沫樣痰，并伴有胸悶氣喘，呼吸困難，每年持續(xù)3個(gè)月以上。多次于我院就診，診斷為：慢性阻塞性肺氣腫、支氣管擴(kuò)張癥。2017年1月因慢性阻塞性肺氣腫急性發(fā)作入院?；颊呷朐簳r(shí)體溫、血壓、心電圖均正常。有“頭孢菌素、青霉素、氨基酸”藥物過(guò)敏史，無(wú)高血壓病、糖尿病、心臟病等慢性病史。

1.2方法

1.2.1儀器 VITEK2-compact全自動(dòng)微生物分析儀、VITEK MS快速細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，法國(guó)生物梅里埃公司。DL-DYE-GR-16染色儀，珠海迪爾生物工程有限公司。

1.2.2試劑 GN卡、GN13卡，法國(guó)生物梅里埃公司。革蘭氏染色液為珠海迪爾生物工程有限公司產(chǎn)品。藥敏紙片、氧化酶紙片、噢普托欣紙片均為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。血平板與巧克力平板為上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品。10%氫氧化鉀、觸酶試劑均為自配。藥敏判斷參照2017CLSI。

1.2.3質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎鏈球菌ATCC49619和糞腸球菌ATCC29212，均購(gòu)自江蘇英科新創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 根據(jù)標(biāo)本采集要求留取痰標(biāo)本，及時(shí)接種血平板和巧克力平板，同時(shí)涂片。痰直接涂片鏡檢結(jié)果是白細(xì)胞>25/LP，上皮細(xì)胞<10/LP，為合格痰，革蘭染色主要見(jiàn)G-桿菌；痰培養(yǎng)24h結(jié)果血平板生長(zhǎng)溶血小菌落，近似草綠色鏈球菌，巧克力平板未生長(zhǎng)。48h血平板的小菌落長(zhǎng)成大黏、不規(guī)則的水滴狀，疑似黏液型肺鏈球菌，72h開(kāi)始菌落又縮小，類(lèi)似于自溶，巧克力平板仍然未生長(zhǎng)。涂片革蘭氏染色為G-桿菌；純化分別轉(zhuǎn)種血平板和巧克力平板，24h血平板見(jiàn)生長(zhǎng)透明小菌落，巧克力平板未生長(zhǎng)。再次涂片革蘭氏染色為G-桿菌；考慮該菌生長(zhǎng)緩慢，為了排除陽(yáng)性菌，做了下列鑒定試驗(yàn)，結(jié)果分別為萬(wàn)古霉素藥敏（R）、10%氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)（+），噢普托欣試驗(yàn)（-），氧化酶（+），觸酶（+），而 VITEK2-compact（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┖唾|(zhì)譜儀鑒定，均未出結(jié)果，KB法（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┧幟舨簧L(zhǎng)；復(fù)傳三代，第四和第五次傳代的血平板上菌落生長(zhǎng)狀態(tài)漸好，巧克力平板從第四代開(kāi)始緩慢生長(zhǎng)。用第五次傳代的菌在VITEK2-compact（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┻M(jìn)行生化鑒定，鑒定編碼為0002041303500000銅綠假單胞菌，98%符合率。藥敏儀器未檢出結(jié)果，用KB法（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬y(cè)出對(duì)阿米卡星、頭孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、氨曲南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素均敏感，左氧氟沙星、亞胺培南均耐藥。

2　討論

銅綠假單胞菌在血平板可形成五種菌落：典型菌落、大腸菌樣型菌落、黏液性菌落、侏儒型菌落和粗糙型菌落[2]。菌落異常使同一菌株被誤認(rèn)為是不同的細(xì)菌，給細(xì)菌的鑒定帶來(lái)困難。黏液型細(xì)菌的胞外多糖具有干擾正常宿主吞噬防御和促進(jìn)生物膜形成的能力，與肺功能下降和預(yù)后差有關(guān)[3]，影響治療效果。黏液性菌落變異型在囊性纖維化患者的呼吸道標(biāo)本中很常見(jiàn)，與間歇性定植相關(guān)，黏液型細(xì)菌的出現(xiàn)也是慢性感染的一個(gè)標(biāo)志[4]。

目前，針對(duì)不典型銅綠假單胞菌，尤其生長(zhǎng)緩慢的黏液型銅綠假單胞菌，無(wú)較好的檢測(cè)方法和手段，一是細(xì)菌生化鑒定儀：比較通用的有增加菌液濃度，但是并無(wú)可靠的文獻(xiàn)支持；二是質(zhì)譜：去除菌落表面的黏液，取基底部的細(xì)菌做質(zhì)譜檢測(cè)。這兩種方法雖能鑒定出細(xì)菌，但藥敏試驗(yàn)常因?yàn)椴簧L(zhǎng)而無(wú)結(jié)果。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，黏液型銅綠假單胞菌和非黏液型銅綠假單胞菌之間可以相互轉(zhuǎn)變。將黏液型銅綠假單胞菌經(jīng)傳代的方式進(jìn)行反祖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代后，較容易恢復(fù)為非黏液型銅綠假單胞菌利于鑒定和藥敏試驗(yàn)。本案例慢生長(zhǎng)黏液型銅綠假單胞菌最初用上述兩種方法檢測(cè)均未出結(jié)果，經(jīng)過(guò)5次傳代生長(zhǎng)良好后用細(xì)菌生化鑒定儀鑒定出結(jié)果，藥敏仍然未出結(jié)果，最終用KB（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┓y(cè)出藥敏結(jié)果。最佳的傳代次數(shù)還在試驗(yàn)中，有待繼續(xù)探討。

綜上所述，我們認(rèn)為在遇到細(xì)菌菌落不典型的情況下要參考痰涂片的結(jié)果，痰涂片革蘭氏染色鏡檢能客觀地反映細(xì)菌感染的真實(shí)情況，給痰培養(yǎng)提供一定的指導(dǎo)作用[6]，依據(jù)痰涂片結(jié)果在平板尋找相應(yīng)的目標(biāo)菌及時(shí)分離培養(yǎng)，針對(duì)該目標(biāo)菌找出最合適的鑒定方法，及時(shí)檢測(cè)出藥敏試驗(yàn)結(jié)果，才能更好地服務(wù)于臨床。

1趙德軍，付維嬋，胡照宇，等.慢性阻塞性肺疾病患者下呼吸道感染銅綠假單胞菌耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（11）：2340-2341

2張秀珍，朱德妹.臨床微生物檢驗(yàn)問(wèn)與答[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：146

3 Farrell PM，Collins J，Broderick LS，et al.Association between mucoid Pseudomonas infection and bronchiectasis in children with cystic fibrosis[J].Radiology，2009，252（2）：534-543

4詹姆斯H.約根生，邁克爾A.普法勒，主編，王輝.等譯.臨床微生物學(xué)手冊(cè)[M].11版.北京：中華醫(yī)學(xué)電子音像出版社，2017：984-988

5李瑜珍，曾學(xué)輝，李忠新，等.痰粘液型銅綠假單胞菌的分離及耐藥性分析 [J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（5）：1059-1060

6尚紅，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：636-638