金璐頔 徐晶晶 張 勇 余躍洲 劉 暢 趙東平 葉安培,,*

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軟骨細(xì)胞體外增殖去分化的拉曼光譜分析

金璐頔1徐晶晶2張 勇3余躍洲2劉 暢3趙東平3葉安培1,3,*

(1北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院，北京 100871；2北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100871；3北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，納米器件物理與化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100871)

基于顯微拉曼光譜技術(shù)，對(duì)組織工程的軟骨種子細(xì)胞在傳代增殖過(guò)程中的去分化進(jìn)行單細(xì)胞分析。首先，對(duì)體外單層培養(yǎng)的第1?4代(P1?P4)大鼠軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行了單細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)，由此識(shí)別出軟骨細(xì)胞中各種堿基、糖基、氨基酸等主要物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特征峰集合。隨后，分析拉曼光譜中若干重點(diǎn)特征峰強(qiáng)度隨細(xì)胞傳代次數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞體外增殖過(guò)程中核酸(789、1094、1576 cm?1)含量降低、II型膠原(特異組分為羥脯氨酸，1207 cm?1)和蛋白聚糖(特異組分為糖胺聚糖，1042、1063、1126、1160 cm?1)合成下降、脂質(zhì)(1304 cm?1)及磷酸鹽(957 cm?1)含量增加等分子水平變化，從而在活體單細(xì)胞層次初步揭示了去分化引起軟骨細(xì)胞增殖變緩、分泌減弱、形態(tài)纖維化等現(xiàn)象的分子機(jī)制。

軟骨細(xì)胞；去分化；單細(xì)胞分析；顯微拉曼光譜；分子機(jī)制

1 引言

軟骨是哺乳動(dòng)物重要的結(jié)締組織，由軟骨細(xì)胞(chondrocyte)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)構(gòu)成。人體中的關(guān)節(jié)透明軟骨有承受負(fù)荷、減少關(guān)節(jié)間骨骼摩擦等重要功能，也因此而易消耗磨損，更有退行性病變所引發(fā)的關(guān)節(jié)炎、髕骨軟化癥等高發(fā)軟骨病癥。由于軟骨組織中一般不存在血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞增殖能力較為有限1，受損后很難自行痊愈，且傳統(tǒng)治療方法鮮有持久的良好效果。組織工程為解決軟骨疾病問(wèn)題創(chuàng)造了新的可能，即用“基質(zhì)誘導(dǎo)下的軟骨細(xì)胞移植(matrix-induced chondrocyte implantation，MCI)”技術(shù)，將自體或異體(如鼠、兔等動(dòng)物)軟骨細(xì)胞植入具有誘導(dǎo)生長(zhǎng)作用的三維支架中，再將支架整體移植到患者的受損關(guān)節(jié)軟骨處，使其中的細(xì)胞不斷生長(zhǎng)、分裂并持續(xù)產(chǎn)生膠原蛋白等ECM成分，修補(bǔ)病變部位以實(shí)現(xiàn)軟骨病癥的治愈2?5。

種子細(xì)胞作為組織工程三大要素之一，在很大程度上決定了軟骨移植的修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)室條件下單層傳代的傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)模式實(shí)現(xiàn)容易、操作簡(jiǎn)單，但研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)代數(shù)和時(shí)間的增加，軟骨種子細(xì)胞會(huì)逐漸喪失其正常細(xì)胞表型6?9，與體內(nèi)關(guān)節(jié)透明軟骨的原有細(xì)胞產(chǎn)生較大差異。這種現(xiàn)象被定義為“去分化(dedifferentiation)”，很可能引起所植入軟骨組織的整體纖維化10，甚至誘發(fā)關(guān)節(jié)炎11，嚴(yán)重影響MCI技術(shù)的臨床效果。軟骨細(xì)胞體外增殖去分化的具體表現(xiàn)為：(1) 細(xì)胞增殖速度逐漸下降，生長(zhǎng)曲線漸趨飽和，在若干次傳代后完全停止增殖；(2) 通過(guò)顯微鏡或電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)由圓形、多角形漸變?yōu)轭愃瞥衫w維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形12；(3) 通過(guò)組織學(xué)染色等方法，發(fā)現(xiàn)去分化軟骨組織ECM中的II型膠原和蛋白聚糖含量降低13，而它們是由組織中的軟骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生；(4) 軟骨細(xì)胞自身力學(xué)特性發(fā)生較大改變，與MCI三維支架材料的結(jié)合力也下降14。目前學(xué)界對(duì)軟骨細(xì)胞去分化現(xiàn)象的單細(xì)胞研究成果較為有限，對(duì)其內(nèi)部分子機(jī)制也尚不清楚。

拉曼光譜技術(shù)的原理基于樣品分子振動(dòng)所引起對(duì)入射光的非彈性散射，不同物質(zhì)分子因散射光的不同頻率移動(dòng)而在光譜上有特異性的位置分布，光譜峰值強(qiáng)度則代表該物質(zhì)相對(duì)含量。拉曼光譜是表征樣品化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)信息的有力工具，業(yè)已成為化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等交叉學(xué)科領(lǐng)域卓有成效的研究手段15,16。顯微拉曼光譜技術(shù)的信噪比與空間分辨率較高，相比其他單細(xì)胞分析技術(shù)具有無(wú)標(biāo)記、無(wú)損傷的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)分布及動(dòng)態(tài)變化過(guò)程17,18。目前，單細(xì)胞顯微拉曼光譜已應(yīng)用于細(xì)胞癌變臨床診斷19、細(xì)胞個(gè)體老化檢測(cè)20、人體血細(xì)胞早期病變篩查21等方向。在軟骨醫(yī)學(xué)方面，Kunstar等22通過(guò)拉曼光譜檢測(cè)了不同層次軟骨組織的成分差異；Kumar等23則探究了不同程度的關(guān)節(jié)炎組織中軟骨細(xì)胞的拉曼光譜差異。

有鑒于此，我們測(cè)定了體外單層培養(yǎng)第1?4代軟骨細(xì)胞的顯微拉曼光譜，通過(guò)數(shù)據(jù)處理與文獻(xiàn)比對(duì)，表征了單個(gè)軟骨細(xì)胞內(nèi)多種特征分子結(jié)構(gòu)，定量分析細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中關(guān)鍵成分的變化趨勢(shì)，進(jìn)而從分子生化效應(yīng)的角度詮釋軟骨細(xì)胞體外增殖中的去分化現(xiàn)象。本工作為進(jìn)一步研究軟骨細(xì)胞去分化奠定了分析基礎(chǔ)，也對(duì)組織工程學(xué)的機(jī)制探索與技術(shù)檢驗(yàn)有一定指導(dǎo)意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 顯微拉曼實(shí)驗(yàn)平臺(tái)構(gòu)建

相關(guān)實(shí)驗(yàn)在我們自建的共聚焦顯微拉曼實(shí)驗(yàn)平臺(tái)(詳細(xì)結(jié)構(gòu)如圖1所示)上進(jìn)行。由固體激光器(Excelsior-532-200-CDRH，美國(guó)Spectra-Physics公司)發(fā)出的532 nm波長(zhǎng)單模激光經(jīng)外光路擴(kuò)束、準(zhǔn)直后導(dǎo)入顯微鏡(Axiovert 200，德國(guó)Zeiss公司)，最終通過(guò)高數(shù)值孔徑物鏡(100 × 油鏡，數(shù)值孔徑N.A. = 1.3)聚焦于樣品。實(shí)驗(yàn)中控制樣品處激光功率為10 mW的較低值，以免對(duì)細(xì)胞造成熱損傷。

圖1 本工作所用的共聚焦顯微拉曼實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

Color online.

2.2 軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng)

大鼠軟骨細(xì)胞樣品由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院朱敬先老師、李晨曦博士等饋贈(zèng)，采集過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用和保護(hù)指南。取一只6月齡健康大鼠放血處死，隨即在無(wú)菌條件下解剖分離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)面軟骨，其間注意細(xì)致剝離其表面的關(guān)節(jié)滑膜等纖維組織。切下的軟骨組織立即用含有“雙抗”(含青霉素、鏈霉素各100 μg?mL?1，美國(guó)Hyclone公司)的足量PBS緩沖液(邁晨科技)連續(xù)沖洗3次，再在培養(yǎng)基環(huán)境下快速切成約1 mm3大小的碎片，放置在15 mL無(wú)菌離心管中，加濃度為0.2%的II型膠原蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，37°C下靜置消化過(guò)夜。次日加血清終止消化，用細(xì)胞篩過(guò)濾消化物，將濾液以1000 r?min?1速度離心10 min并棄上清液。對(duì)沉淀中細(xì)胞用PBS緩沖液繼續(xù)沖洗、離心3次后，將密度調(diào)整為1.5 × 105個(gè)/mL，接種在T25培養(yǎng)瓶中開始原代培養(yǎng)。

對(duì)軟骨細(xì)胞采用傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)方式，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下進(jìn)行，所用培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)配比為：89%的DME/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，含2.5 mmol?L?1谷氨酰胺)、10%的澳洲胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、1%的雙抗(美國(guó)Hyclone公司)，每3天定時(shí)更換1次培養(yǎng)基。每6天(144 h)觀察到細(xì)胞增殖至覆蓋瓶底面積的80%以上(預(yù)示將發(fā)生接觸抑制)，此時(shí)用胰蛋白酶(濃度為0.25%，邁晨科技)消化細(xì)胞后均分為4份，其中3份用于繼續(xù)傳代培養(yǎng)，1份用于光譜實(shí)驗(yàn)。

在傳代過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，該大鼠軟骨細(xì)胞在第5代時(shí)雖經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)和多次更換培養(yǎng)基，其貼壁密度仍無(wú)明顯增加跡象，即基本失去增殖能力而無(wú)法進(jìn)行下一次傳代。同時(shí)，在顯微鏡下也觀察到貼壁狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞從第1代的圓形、橢圓形逐漸變形，到第4代已呈現(xiàn)長(zhǎng)梭狀的類纖維化形態(tài)，證明軟骨細(xì)胞去分化實(shí)際發(fā)生于第1–4代的傳代培養(yǎng)過(guò)程中。因此，我們選取所培養(yǎng)的前4代軟骨細(xì)胞作為拉曼光譜分析對(duì)象。

2.3 拉曼光譜采集與分析

將上述準(zhǔn)備好的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞樣品用PBS緩沖液以1000 r?min?1、3 min沖洗離心3次，最后加10倍體積PBS緩沖液稀釋后得到待測(cè)細(xì)胞懸浮樣。取該懸浮樣100 μL加入自制的石英玻片樣品池中，在顯微鏡下隨機(jī)尋找50個(gè)形狀圓潤(rùn)、邊緣明顯、直徑范圍為12?16 μm的存活細(xì)胞個(gè)體作為該組樣本，以減小樣本誤差干擾。為了避免細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)成分差異帶來(lái)誤差，每次實(shí)驗(yàn)對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞核中心位置采集光譜30 s，每個(gè)細(xì)胞僅采集一次。為扣除背景影響，每組實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞同一焦面上對(duì)臨近區(qū)域的PBS緩沖液采集一組背景拉曼光譜。另外，鑒于相鄰兩組拉曼光譜的采集間隔長(zhǎng)達(dá)6天，故在每次正式采集光譜之前均用直徑為5 μm的聚苯乙烯微球(美國(guó)Bangs Laboratories)進(jìn)行標(biāo)定，以確保光譜儀工作狀態(tài)始終保持一致。

將所檢測(cè)的第1?4代細(xì)胞依次記為P1?P4組，每組包含同一代細(xì)胞的50個(gè)拉曼光譜數(shù)據(jù)，即4組總數(shù)據(jù)量為200。在Matlab (美國(guó)MathWorks公司)軟件編程環(huán)境下，每個(gè)光譜數(shù)據(jù)依次經(jīng)過(guò)去除宇宙射線、扣除背景光譜、9點(diǎn)平滑濾波的同一套處理流程，并以1001 cm?1峰值為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，這也是為了進(jìn)一步排除不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間的系統(tǒng)狀態(tài)偏差。

如圖2所示，歸一化后的P1?P4組拉曼光譜在400?1700 cm?1范圍內(nèi)的多個(gè)波數(shù)區(qū)間都存在明顯的組間差異，但圖中代表各組光譜標(biāo)準(zhǔn)誤的灰色陰影部分寬度有限，這說(shuō)明細(xì)胞光譜數(shù)據(jù)的組內(nèi)差異相對(duì)較小。因此為方便起見，我們直接選用每組軟骨細(xì)胞的均值拉曼光譜，在后續(xù)統(tǒng)計(jì)比較中采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)，通常當(dāng)假設(shè)檢驗(yàn)成立概率< 0.05時(shí)可認(rèn)為相關(guān)光譜強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性。

圖2 P1–P4組細(xì)胞歸一化后的均值拉曼光譜

The colored (P1 = orange, P2 = violet, P3 = brown, P4 = green) solid lines indicate the average spectra normalized according to the peak intensities at 1001 cm?1. The grey-shaded areas represent the standard errors. The Raman excitation wavelength is 532 nm. Color online.

3 結(jié)果與討論

3.1 軟骨細(xì)胞組分的拉曼光譜歸屬

如圖3所示，用MATLAB軟件可自動(dòng)識(shí)別出P1?P4組軟骨細(xì)胞均值拉曼光譜的多個(gè)共有振動(dòng)特征峰如789、861、935、1001、1121、1163、1245、1442、1572、1652 cm?1等(考慮到峰移影響，在此取P1組均值拉曼光譜的峰位波數(shù)值)，分別代表細(xì)胞中含量較為豐富的多種分子振動(dòng)模式。除此之外，4組拉曼光譜中還各有一些較弱特征峰存在。比照前人文獻(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞及組織內(nèi)主要成分的拉曼譜峰歸屬24?35，篩選其中可明確解析、具有代表性的17個(gè)特征峰集合，列出其在P1?P4組光譜上的波數(shù)位置如表1所示。這些峰分別指示軟骨細(xì)胞中堿基、氨基酸、酰胺鍵、糖基、脂質(zhì)鏈等分子結(jié)構(gòu)，考慮到不同實(shí)驗(yàn)條件下拉曼光譜可能存在微小的波數(shù)差異，測(cè)得峰位與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的符合程度較好。

魔方學(xué)習(xí)是結(jié)合學(xué)校的拓展性課程進(jìn)行的，平均一星期一次，但是學(xué)生對(duì)魔方的主動(dòng)探究與學(xué)習(xí)不局限于這一節(jié)課。憑著對(duì)魔方的興趣，他們一有空余時(shí)間，就獨(dú)自一人或者三五成群地聚在一起研究，使得本次任務(wù)性學(xué)習(xí)能順利進(jìn)行。

圖3 P1–P4組軟骨細(xì)胞均值拉曼光譜的共有特征峰

The colored (P1 = orange, P2 = violet, P3 = brown, P4 = green) solid lines indicate the normalized spectra, which are vertically offset for clarity. The Raman excitation wavelength is 532 nm. Color online.

4組軟骨細(xì)胞均值拉曼光譜間的差異性顯示出相應(yīng)生化成分在細(xì)胞傳代過(guò)程中的變化，這有助于軟骨細(xì)胞去分化分子機(jī)制的初步鑒識(shí)：一方面，多數(shù)共有特征峰從P1組到P4組發(fā)生峰位移動(dòng)，如861 cm?1特征峰的總體紅移與935、1121 cm?1特征峰的總體藍(lán)移都源于蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的改變34；另一方面，我們也觀察到部分特征峰在P1?P4組有明顯的強(qiáng)度差異，如代表胡蘿卜素的1515 cm?1特征峰僅在P3組出現(xiàn)，這在一定程度上反映出軟骨細(xì)胞內(nèi)分子含量的動(dòng)態(tài)變化。

3.2 軟骨細(xì)胞去分化的分子變化分析

根據(jù)前述軟骨細(xì)胞去分化過(guò)程的具體表現(xiàn)，其生化考察應(yīng)至少關(guān)注三個(gè)方面，即：細(xì)胞增殖活力(遺傳物質(zhì)復(fù)制速率)、細(xì)胞分泌活性(特別是對(duì)ECM中主要組分的分泌效率36)、細(xì)胞表型變異(反映自身化學(xué)成分變化)。為了在分子生化水平上解析這些現(xiàn)象，我們對(duì)P1?P4組均值拉曼光譜的多個(gè)特征峰強(qiáng)度進(jìn)行代際對(duì)比(見圖4，此處忽略各組光譜峰位移動(dòng)影響)，希望以此揭示軟骨細(xì)胞內(nèi)各類物質(zhì)的相對(duì)含量變化。

3.2.1 核酸(DNA/RNA)分子含量變化

作為遺傳信息載體，DNA和RNA的含量既表示細(xì)胞分裂增殖活力，也直觀反映細(xì)胞分泌表達(dá)能力。DNA和RNA分子結(jié)構(gòu)高度近似，故分析時(shí)將兩者合并為“核酸(DNA/RNA)”一類。

根據(jù)文獻(xiàn)35，787、1094、1576 cm?1為核酸分子的3個(gè)特征峰，分別代表DNA/RNA中磷酸二酯鍵、各種堿基等分子結(jié)構(gòu)的振動(dòng)模式。如圖4(a)所示，可以發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，各峰值強(qiáng)度均呈明顯下降的總體趨勢(shì)，說(shuō)明在去分化過(guò)程中軟骨細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化特性有弱化傾向。注意到P2組1094 cm?1峰值強(qiáng)度相比P1組略有增加，我們認(rèn)為軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)的最初階段應(yīng)先經(jīng)歷一個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)有所改善的適應(yīng)期，之后才受到去分化的明顯影響。

3.2.2 蛋白聚糖分子含量變化

軟骨ECM中有諸多特異性大分子，包括蛋白聚糖，II、IX、XI型膠原，基質(zhì)蛋白，軟骨連接蛋白等。其中，II型膠原和蛋白聚糖占比較大，兩者相互結(jié)合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使軟骨具有一定彈性，對(duì)維持軟骨形狀、承載外來(lái)負(fù)荷起到重要作用，也是評(píng)價(jià)軟骨細(xì)胞分泌功能的主要標(biāo)準(zhǔn)13。

表1 P1–P4組軟骨細(xì)胞拉曼光譜特征峰位置及其歸屬24–35

透明軟骨組織內(nèi)的蛋白聚糖由一個(gè)核心蛋白與一條或多條側(cè)鏈糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)等以共價(jià)鍵連接構(gòu)成，并通過(guò)連接蛋白與透明質(zhì)酸分子相結(jié)合37。蛋白聚糖中常見的GAG分子類型有硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素等。

參照表1及其他文獻(xiàn)38,39，我們選取1042、1063、1126、1160 cm?1為軟骨細(xì)胞中GAG分子結(jié)構(gòu)的4個(gè)特征峰，如圖4(b)所示。其中，1063 cm?1峰可表征硫酸基團(tuán)31，與硫酸軟骨素與硫酸角質(zhì)素有關(guān)，可視為GAG的強(qiáng)特異性峰。我們發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)特征峰的強(qiáng)度雖在P1?P2階段有所增加(亦可視為細(xì)胞經(jīng)歷初始適應(yīng)期的狀態(tài)表現(xiàn))，但在之后的P2?P4階段又呈現(xiàn)出明顯下降的總趨勢(shì)，說(shuō)明軟骨細(xì)胞中GAG的合成水平有所減弱，這與受到去分化影響的羊肋軟骨組織GAG染色結(jié)果40一致。GAG合成下降可能與蛋白激酶C(PKC)基因表達(dá)受到抑制的原理41有關(guān)，這有待于合成生物學(xué)的進(jìn)一步探究。

3.2.3 II型膠原分子含量變化

在關(guān)節(jié)透明軟骨的膠原總量中，II型膠原占比達(dá)80%以上，為軟骨提供了特有的張力和硬度，是軟骨細(xì)胞高度分化、軟骨組織趨于成熟的標(biāo)志。II型膠原中富含羥脯氨酸，且羥脯氨酸上的羥基幾乎全部與糖類結(jié)合，因而糖化率較高。與之相反的是I型膠原，不含羥脯氨酸組分而含糖量低，作為動(dòng)物組織纖維形成膠原在人體內(nèi)有更為廣泛的分布，特別是在成熟骨質(zhì)中起到關(guān)鍵作用42。

我們?cè)诖藘H選取1207 cm?1特征峰，如圖4(c)所示，觀察到該特征峰的強(qiáng)度隨軟骨細(xì)胞傳代次數(shù)遞增而有所下降。1207 cm?1峰特異性表征苯環(huán)的伸縮振動(dòng)，其峰值下降源于軟骨細(xì)胞中羥脯氨酸(通常含苯環(huán)結(jié)構(gòu))的減少43。這一現(xiàn)象說(shuō)明軟骨細(xì)胞在去分化時(shí)對(duì)II型膠原的分泌減弱，對(duì)應(yīng)去分化軟骨細(xì)胞表型纖維化過(guò)程中II型膠原向I型膠原的轉(zhuǎn)化44。

另外，我們還發(fā)現(xiàn)圖4(d)中隨著軟骨細(xì)胞代數(shù)的增加，1246與1270 cm?1兩個(gè)特征峰的強(qiáng)度比值(1246)/(1270)明顯上升。已知1245?1279 cm?1區(qū)域被稱為蛋白質(zhì)拉曼光譜的酰胺III帶(amide III)，其中1246 cm?1峰與1270 cm?1峰各自代表蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無(wú)規(guī)卷曲和有序卷曲45,46。這兩個(gè)特征峰的強(qiáng)度比上升，表明去分化會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的無(wú)規(guī)卷曲減少、有序卷曲增加，即對(duì)軟骨細(xì)胞的II型膠原網(wǎng)絡(luò)造成一定破壞47。

圖4 P1–P4組軟骨細(xì)胞若干拉曼特征峰的相對(duì)強(qiáng)度比較

Dependences of the peak intensities are shown as functions of chondrocyte passage number (1?4): (a) 787, 1094, 1576 cm?1;(b) 1042, 1063, 1126, 1160 cm?1; (c) 1207 cm?1; (d) 1246 cm?1to 1270 cm?1; (e) 1304 cm?1; (f) 957 cm?1.Data represent the normalized mean intensities of Raman peaks, and bars represent the standard errors. Color online.

3.2.4 脂質(zhì)分子含量變化

1304 cm?1峰通常被認(rèn)為是細(xì)胞中脂質(zhì)分子的CH2/CH3振動(dòng)特征峰48。由圖4(e)可以看到，該峰強(qiáng)度隨軟骨細(xì)胞增殖代數(shù)增加呈上升趨勢(shì)，故可認(rèn)為脂質(zhì)在去分化軟骨細(xì)胞中含量增加。但鑒于迄今尚無(wú)軟骨細(xì)胞去分化與脂質(zhì)分子關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，故該結(jié)果還需要其他方面研究的支持。

3.2.5 磷酸鹽含量變化

生物體內(nèi)主要的礦化無(wú)機(jī)鹽成分為磷酸鹽(特征峰在957 cm?1，代表物質(zhì)為羥基磷灰石，主要分布于骨纖維組織中)。圖4(f)中957 cm?1峰強(qiáng)度49隨細(xì)胞傳代有上升趨勢(shì)，說(shuō)明軟骨細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽成分的確有所增加。

4 結(jié) 論

我們基于單細(xì)胞顯微拉曼光譜技術(shù)，檢測(cè)了體外單層培養(yǎng)第1?4代大鼠軟骨細(xì)胞的化學(xué)組成。通過(guò)對(duì)拉曼光譜主要特征峰強(qiáng)度的比較分析，得到軟骨細(xì)胞體外增殖去分化過(guò)程中若干重要組分的變化趨勢(shì)：核酸含量減少，蛋白聚糖與II型膠原分泌水平下降，脂質(zhì)與磷酸鹽含量增加等。去分化會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞表型改變、功能失調(diào)，不利于組織工程的應(yīng)用。本研究結(jié)果有助于在分子水平上揭示軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)中的去分化機(jī)制，從而對(duì)MCI技術(shù)優(yōu)選種子細(xì)胞、克服去分化影響提供指導(dǎo)。

此外，調(diào)整細(xì)胞密度、添加調(diào)控因子50、改變培養(yǎng)環(huán)境51等措施都能有效提升傳統(tǒng)單層細(xì)胞培養(yǎng)方法的效率，更有三維支架、離心管、生物反應(yīng)器等諸多改進(jìn)型培養(yǎng)方法52。在本工作基礎(chǔ)上，結(jié)合拉曼光譜技術(shù)，可以對(duì)所培養(yǎng)的軟骨種子細(xì)胞分別進(jìn)行質(zhì)量鑒定，并直觀對(duì)比這些培養(yǎng)方法對(duì)細(xì)胞去分化的實(shí)際抑制效果。

本研究結(jié)果也表明，在細(xì)胞分子機(jī)制的定量研究方面，無(wú)標(biāo)記、無(wú)損傷的單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)確有一定優(yōu)勢(shì)，有望應(yīng)用于更廣泛的組織工程學(xué)課題研究。

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Raman Spectroscopic Analysis of Chondrocyte Dedifferentiation duringProliferation

JIN Lu-Di1XU Jing-Jing2ZHANG Yong3YU Yue-Zhou2LIU Chang3ZHAO Dong-Ping3YE An-Pei1,3,*

(1;2;3)

Seeded chondrocytes play a crucial role in current cartilage tissue engineering, yet both the quality and quantity of these cells could be impaired owing to cell dedifferentiation duringproliferation. Here, we used micro-Raman spectroscopy to investigate changes in cellular components upon monolayer culturing of primary rat chondrocytes through multiple passages. Based on the average spectral profiles, we detected a series of Raman peaks and recognized related radicals such as nucleobases, pyranose rings, sulfate, tyrosine, proline, and amides at the single-chondrocyte level. Quantitative analysis of the Raman peak intensities showed that nucleic acids (at 789, 1094, 1576 cm?1) decreased significantly from passage 1 (P1) to passage 4 (P4), whereas lipids (at 1304 cm?1) and phosphate (at 957 cm?1) increased significantly. Moreover, the syntheses of two major hyaline cartilage-associated proteins, aggrecan and type-2 collagen, were impeded, as indicated by the marked decline in the levels of their specific components (glycosaminoglycan at 1042, 1063, 1126, 1160 cm?1, and hydroxyproline at 1207 cm?1). Taken together, these featuresreveal thediminished propagation and secretion abilities of passaged chondrocytes needed for matrix-induced implantation, and shed light on the molecular mechanism of chondrocyte dedifferentiation.

Chondrocyte; Dedifferentiation; Single-cell analysis; Micro-Raman spectroscopy; Molecular mechanism

May 2, 2017;

June 5, 2017;

June 13, 2017.

Corresponding author. Email: yap@pku.edu.cn; Tel: +86-10-62762323.

10.3866/PKU.WHXB201706133

O641

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (U1636110), the National Key Technologies R&D Program of China (2012BAF14B14), and the Medicine-Informatics Interdisciplinary Project of Peking University, China (2014-MI-19).

國(guó)家自然科學(xué)基金(U1636110), 科技部“科技支撐計(jì)劃”(2012BAF14B14)及北京大學(xué)“醫(yī)學(xué)-信息”交叉研究種子基金(2014-MI-19)資助項(xiàng)目