， ，

腦性癱瘓(cerebral palsy，CP)簡(jiǎn)稱腦癱，是一種非進(jìn)行性腦損傷所致的，以姿勢(shì)異常和運(yùn)動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)的綜合征，多在小兒出生前至出生后1個(gè)月內(nèi)發(fā)生，常合并有感知覺(jué)障礙、智力障礙等癥狀[1]。CP不僅對(duì)患兒的生長(zhǎng)發(fā)育及日后生活帶來(lái)巨大影響，而且給患兒家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床上尚無(wú)確切治療腦癱的方法，也無(wú)有效藥物，只能依靠綜合治療方法進(jìn)行早期康復(fù)治療[2]。干細(xì)胞移植技術(shù)及基因臨床治療技術(shù)日新月異的發(fā)展，為CP患兒的治療康復(fù)提供了新途徑[3]。為了探討干細(xì)胞移植是否對(duì)CP的治療有效，本研究采用改良的HIE手術(shù)方法對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行腦癱建模，建模后行側(cè)腦室內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植治療，并對(duì)模型組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果、Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間以及腦室旁白質(zhì)中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的含量進(jìn)行對(duì)比分析，以探究側(cè)腦室內(nèi)NSCs移植對(duì)腦癱鼠模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只7日齡健康、SPF級(jí)Wistar大鼠，體重13 g～15 g，均喂養(yǎng)于自由進(jìn)食、進(jìn)水，相對(duì)濕度45%～60%，室溫23℃～25℃，光照12 h的環(huán)境中；大鼠購(gòu)買自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SYXK(新)2015-0004。

1.2 藥品與儀器 側(cè)腦室神經(jīng)干細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自行配置[4]；兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)由漢博士德生物工程有限公司提供；生物顯微鏡BX50F4，由日本OLYPUS公司提供。

1.3 動(dòng)物分組與建模 建模方法：除對(duì)照組外，對(duì)48只大鼠行改良HIE造模方法。所有大鼠麻醉后，固定在手術(shù)板上，頸前正中作切口，分離并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈，然后縫合切口；將大鼠置于37℃的水封閉缺氧箱中，氧氣含量為8%，維持2 h；對(duì)建模后的大鼠，參考Hideyuki[5]的方法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)及病理學(xué)檢查，選取24只建模成功大鼠。 對(duì)照組假手術(shù)后，給予等量生理鹽水。 模型組造模后回籠飼養(yǎng)，給予等量生理鹽水。 NSCs組(實(shí)驗(yàn)組)建模3 d后給予NSCs移植。

1.4 治療方法 實(shí)驗(yàn)組大鼠建模3 d后，麻醉并進(jìn)行顱骨鉆孔。將大鼠置于立體定向儀頭架上，進(jìn)行左側(cè)腦室穿刺，微量泵緩慢注入2 μLNSCs移植液。注射后留針2 min，采用骨蠟將注射針孔封閉，縫合頭皮。

1.5 病理組織觀察 心臟灌注后，進(jìn)行斷頭取腦，采用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定。24 h后，在腦前鹵取冠狀腦組織約1 mm，作石蠟切片。經(jīng)HE染色后，固定、晾干，光鏡下觀察。

1.6 觀察指標(biāo)及評(píng)估方法 對(duì)比各組大鼠在42日齡時(shí)的Morris水迷宮溺水逃避潛伏期時(shí)間差異，Morris水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年(1981)代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究的一種實(shí)驗(yàn)手段。將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)。采用懸吊實(shí)驗(yàn)(大鼠前腿抓住粗0.5 cm的玻璃棒，觀察其掉下的時(shí)間，<10 s得1分；10 s～30 s得2分；31 s～119 s得3分；2 min～5 min得4分；>5 min得5分)、斜坡實(shí)驗(yàn)(大鼠放置于坡度為45°的斜坡上，觀察大鼠調(diào)轉(zhuǎn)頭的時(shí)間)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(長(zhǎng)寬高分別為36 cm的無(wú)蓋方盒，盒底劃分成9個(gè)等大小的格子，觀察記錄大鼠活動(dòng)情況，大鼠1/2以上身體部位進(jìn)入相鄰方格計(jì)為1分，大鼠后肢性站立得1分，二者相加為其總分)，評(píng)定各組大鼠的神經(jīng)行為能力。

對(duì)比各組大鼠的腦室旁白質(zhì)中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)含量差異。免疫組化法檢測(cè)GFAP含量。斷頭取腦后制作石蠟切片；切片脫蠟脫水，微波抗原修復(fù)約20 min，3%H2O2室溫孵育10 min，BSA室溫封閉10 min，兔抗大鼠GFAP抗體處理4℃過(guò)夜。二抗37℃下孵育20 min，SABC試劑于37℃下孵育20 min。HE染色，經(jīng)脫水、透明后采用中性樹(shù)脂封片。晾干、待檢。400倍鏡下每張切片同一部位隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，采用數(shù)碼相機(jī)圖像采集系統(tǒng)采圖。Imageproplus6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，免疫組化檢測(cè)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求其平均數(shù)作為最后的陽(yáng)性結(jié)果，并記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 病理切片結(jié)果分析 正常組大鼠腦室周圍組織中細(xì)胞排列規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞、軟化灶形成(見(jiàn)圖1A)；模型組大鼠的腦室周圍組織中可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)變性、腫脹、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，軟化灶形成(見(jiàn)圖1B)；NSCs組的病理嚴(yán)重程度較模型組顯著的減輕(見(jiàn)圖1C)。

注：A為正常組，B為模型組，C為NSCs組(100倍)。

圖1 HE染色觀察

2.2 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間比較 42日齡時(shí)，模型組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間顯著長(zhǎng)于NSCs組和正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NSCs組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間顯著長(zhǎng)于正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠神經(jīng)行為能力測(cè)定 42日齡時(shí)，模型組大鼠的斜坡實(shí)驗(yàn)時(shí)間顯著長(zhǎng)于NSCs組和正常組大鼠，懸吊試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)分顯著低于NSCs組和正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NSCs組大鼠的斜坡實(shí)驗(yàn)時(shí)間顯著長(zhǎng)于正常組大鼠，懸吊試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)分顯著的低于正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

組別n懸吊試驗(yàn)(分)斜坡實(shí)驗(yàn)(s)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(分)正常組 123．86±0．722．11±0．3713．61±2．85模型組 12 2．21±0．531)2) 4．20±0．561)2) 7．20±2．231)2)NSCs組123．18±0．671)2．95±0．421)10．42±2．501)F值8．41714．00315．928P0．037<0．001<0．001 與正常組比較，1)P<0．05，與NSCs組比較2)P<0．05。

2.4 各組大鼠腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 42日齡時(shí)，模型組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于NSCs組和正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NSCs組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖2。

組別nGFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(%)F值P正常組1241．3±3．2模型組1262．0±4．715．582<0．001NSCs組1247．8±4．5

注：A為正常組，B為模型組，C為NSCs組(200倍)。

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，腦性癱瘓患兒的生存率逐年上升，腦性癱瘓患兒的治療康復(fù)方法亦成為臨床研究的重點(diǎn)。腦性癱瘓發(fā)病機(jī)制尚不明確，其發(fā)生與圍生期多因素相關(guān)，如早產(chǎn)、低體重、產(chǎn)時(shí)窒息、感染、多胎以及腦室周白質(zhì)軟化等均為腦性癱瘓的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素[6-7]。神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化及自我更新的能力，能夠促進(jìn)損傷腦組織再生，維持神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，近年來(lái)外源性NSCs治療腦損傷已成為臨床研究熱點(diǎn)[8-11]。為探討側(cè)腦室內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)小兒腦癱的治療效果，本研究對(duì)7日齡大鼠進(jìn)行腦癱造模并采用側(cè)腦室內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療。

3組病理組織觀察：正常組大鼠腦室周圍組織中細(xì)胞排列規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞、軟化灶形成；模型組大鼠的腦室周圍組織中可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)變性、腫脹、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，軟化灶形成；NSCs組的病理嚴(yán)重程度較模型組顯著減輕。說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞干預(yù)治療能夠減輕損傷部位炎性反應(yīng)，減緩炎癥浸潤(rùn)，保護(hù)腦室周圍組織細(xì)胞。

3.1 NSCs移植對(duì)腦癱鼠Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間的影響 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)具有視頻攝像跟蹤技術(shù)，能夠避免人為干擾，結(jié)果真實(shí)可靠，被廣泛用于動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力的研究。本研究采用Morris水迷宮對(duì)3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：42日齡時(shí)，模型組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間顯著長(zhǎng)于NSCs組和正常組大鼠；NSCs組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏時(shí)間顯著長(zhǎng)于正常組大鼠。說(shuō)明NSCs移植能夠改善腦癱鼠的智力水平，提升空間學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)腦癱鼠治療具有積極意義。

3.2 NSCs移植對(duì)腦癱鼠神經(jīng)行為能力的影響 42日齡時(shí)，模型組大鼠的斜坡實(shí)驗(yàn)時(shí)間顯著長(zhǎng)于NSCs組和正常組大鼠，懸吊試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)分顯著低于NSCs組和正常組大鼠；NSCs組大鼠的斜坡實(shí)驗(yàn)時(shí)間顯著長(zhǎng)于正常組大鼠，懸吊試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)分顯著低于正常組大鼠。NSCs組的神經(jīng)行為能力明顯高于模型組，說(shuō)明NSCs移植干預(yù)治療后腦癱鼠的神經(jīng)行為能力得到提升。

3.3 NSCs移植對(duì)腦癱鼠腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細(xì)胞之一，具有維持神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)代謝過(guò)程的作用，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibillary acidic protein GFAP)是AS中間纖維所特有一種細(xì)胞骨架蛋白，可作為AS的特征性標(biāo)記物[12-13]。本研究通過(guò)對(duì)3組大鼠腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)，結(jié)果顯示：42日齡時(shí)，模型組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于NSCs組和正常組大鼠；NSCs組大鼠的腦室旁白質(zhì)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于正常組大鼠。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)及抑制神經(jīng)元的雙重作用：神經(jīng)損傷后AS激活，產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及大量GFAP用于損傷修復(fù)；大量GFAP堆積以及AS過(guò)度膠質(zhì)化，可形成機(jī)械阻斷屏障，影響髓殼等的再生。本研究中NSCs組大鼠GFAP數(shù)量大于對(duì)照組，說(shuō)明AS激活，機(jī)體修復(fù)神經(jīng)損傷，但其數(shù)量小于模型組，可以減少AS細(xì)胞過(guò)度膠質(zhì)造成的負(fù)面作用。

腦癱鼠模型采用側(cè)腦室內(nèi)NSCs移植治療，能夠顯著的改善其神經(jīng)行為及學(xué)習(xí)能力，值得臨床對(duì)此方法進(jìn)一步研究使用。

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