陳 麗, 鄭 穎, 陳裕富, 袁秋月, 謝天堯

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275)

氨基酸對(duì)映體手性分離識(shí)別方法中,文獻(xiàn)報(bào)道所采用的手性選擇劑主要有:1.手性氨基酸配體。這類方法通常以中心離子與L- 氨基酸形成的絡(luò)合物作為手性選擇劑,利用手性配體絡(luò)合交換原理來實(shí)現(xiàn)氨基酸對(duì)映體的分離分析[1-3]。2.環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物。環(huán)糊精分子具有中空的圓杯狀結(jié)構(gòu),與手性分子形成穩(wěn)定常數(shù)不同的包合物,從而實(shí)現(xiàn)氨基酸對(duì)映體的分離分析[4,5]。3.冠醚。冠醚是大環(huán)聚醚,分子中間形成空穴,能與大小相當(dāng)?shù)姆肿有纬芍? 客體絡(luò)合物,從而實(shí)現(xiàn)分子識(shí)別[6,7]。4.天然大環(huán)抗生素。大環(huán)抗生素具有天然的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和多個(gè)手性中心,因此可以作為手性選擇劑用于氨基酸對(duì)映體的分離[8,9]。5.手性表面活性劑。利用手性膠束中多個(gè)手性中心與氨基酸對(duì)映體分子之間的氫鍵作用和空間位阻作用實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的手性識(shí)別[10,11]。6.手性離子液體。手性離子液體結(jié)合了離子液體和手性物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)和特性,已成功應(yīng)用于手性物質(zhì)的分離中[12,13]。上述手性選擇劑本身就是手性化合物,氨基酸對(duì)映體在其構(gòu)建的手性介質(zhì)環(huán)境中得以實(shí)現(xiàn)手性分離。目前,對(duì)于在非手性介質(zhì)的電泳運(yùn)行液中實(shí)現(xiàn)氨基酸對(duì)映體的手性識(shí)別,尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

毛細(xì)管電泳(CE)因其高效低耗、可供選擇的分離模式多、分離柱易于清洗、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)已成為氨基酸對(duì)映體分離分析極具吸引力的方法[14,15]。由于絕大部分的氨基酸(除芳香族氨基酸外)沒有紫外- 可見吸收,也不產(chǎn)生熒光,因此采用紫外- 可見和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的CE分析方法,往往需要先進(jìn)行樣品衍生化處理使其具有光學(xué)活性。但是,衍生化過程不僅費(fèi)時(shí)麻煩而且有可能使分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,影響分析結(jié)果,不利于氨基酸對(duì)映體的手性識(shí)別分析。電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)(capacitively coupled contactless conductivity detection,簡稱C4D)是近年來發(fā)展起來一種新型的電導(dǎo)檢測(cè)方法[16,17]。C4D具有分析對(duì)象適用范圍廣、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),是毛細(xì)管電泳中一種性能優(yōu)良的檢測(cè)器,無需衍生化處理,特別適用于檢測(cè)缺乏光學(xué)活性的分子。目前,有關(guān)CE- C4D在氨基酸對(duì)映體分離檢測(cè)方面的應(yīng)用研究報(bào)道還較少,CE- C4D在常見氨基酸的分離分析中極具應(yīng)用前景。本文采用CE- C4D,在非手性介質(zhì)的電泳運(yùn)行液2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅中實(shí)現(xiàn)了D,L- 異亮氨酸對(duì)映體的手性識(shí)別,并對(duì)其手性識(shí)別機(jī)理進(jìn)行了初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

CES2008毛細(xì)管電泳儀(配備非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器,中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院研制); pHS- 3C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠);未涂層石英毛細(xì)管(45 cm×50 μm,河北永年銳沛色譜器件有限公司); KQ2200型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲波儀器有限公司); SGW型旋光儀(上海儀電)。

氫氧化鈉、檸檬酸和乙酸鋅(分析純,廣州化學(xué)試劑廠); D,L- 異亮氨酸、D- 異亮氨酸,L- 異亮氨酸(層析純,上海伯奧生物科技有限公司)。所用水為超純水,由Millipore超純水機(jī)制備。

分別配制0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L檸檬酸、20 mmol/L乙酸鋅的水溶液,實(shí)驗(yàn)時(shí),各取適量以制得不同濃度的電泳運(yùn)行液。異亮氨酸用水配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣時(shí)用電泳運(yùn)行液稀釋至所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將毛細(xì)管柱的兩端在超聲波清洗器中超聲清洗1 min,依次用0.1 mol/L HNO3溶液、超純水、0.1 mol/L NaOH溶液、超純水和電泳運(yùn)行液分別沖洗毛細(xì)管柱5 min。實(shí)驗(yàn)中,每2次進(jìn)樣間僅需用電泳運(yùn)行液沖洗毛細(xì)管3 min。分析過程運(yùn)行10次后,電泳儀兩端的儲(chǔ)液瓶中需更換新鮮的電泳運(yùn)行液。電泳運(yùn)行液為2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅(pH=7.3)。分離電壓+13 kV,電動(dòng)進(jìn)樣+11 kV×8 s。檢測(cè)器的輸出信號(hào)經(jīng)數(shù)據(jù)工作站采集到微機(jī)中進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)處理、圖形顯示和數(shù)據(jù)文件存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)在室溫(25 ℃)、相對(duì)濕度<70%的環(huán)境下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 鋅離子的手性識(shí)別作用

手性配體交換絡(luò)合法是研究較早的分離氨基酸對(duì)映體的方法[1-3]。這種方法通常采用金屬離子與L型氨基酸形成的絡(luò)合物作為手性選擇劑,利用氨基酸對(duì)映體與手性選擇劑之間進(jìn)行配體交換絡(luò)合的差異而達(dá)到分離。在CE- C4D分離檢測(cè)異亮氨酸對(duì)映體的研究中,我們發(fā)現(xiàn)以檸檬酸- Zn2+組成的電泳運(yùn)行液體系替代傳統(tǒng)由金屬離子- L- 氨基酸絡(luò)合物構(gòu)建的運(yùn)行液體系,同樣可以實(shí)現(xiàn)異亮氨酸對(duì)映體的手性分離,且檸檬酸- Zn2+體系更為簡單高效。試驗(yàn)了其他不同的金屬離子,如:Cu2+、CO2+、Ni2+和Mn2+等,結(jié)果表明,只有Zn2+對(duì)異亮氨酸對(duì)映體呈現(xiàn)出手性識(shí)別能力,Zn2+濃度是影響異亮氨酸對(duì)映體分離度的關(guān)鍵因素。固定D,L- 異亮氨酸質(zhì)量濃度為6 mg/L,考察了鋅離子濃度在0～4.0 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)分離度的影響,結(jié)果見圖1。開始隨著Zn2+濃度的增加,對(duì)映體逐漸得到分離,當(dāng)Zn2+濃度為2.0 mmol/L時(shí),分離度達(dá)最大;繼續(xù)增大Zn2+濃度,則會(huì)引起電泳電流的增大和焦耳熱的增加,分離度變差,不利于分離。故本實(shí)驗(yàn)選取的Zn2+最佳濃度為2.0 mmol/L。

圖 1 鋅離子濃度對(duì)異亮氨酸對(duì)映體分離的影響Fig. 1 Effect of Zn2+concentration on the enantio- separation of D,L- isoleucine Running buffer: 2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L citric acid+c(Zn2+) zinc acetate; separation voltage: 13 kV; electrokinetic injection: 11 kV×8 s.

2.2 CE條件的優(yōu)化

在CE實(shí)驗(yàn)中,需要優(yōu)化的條件主要有電泳運(yùn)行液的組成和濃度、分離電壓、進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間。

電導(dǎo)檢測(cè)器輸出的分析信號(hào)強(qiáng)度取決于待測(cè)組分的電導(dǎo)值與電泳運(yùn)行液背景電導(dǎo)之間的差值。因此,通過選擇合適的電泳運(yùn)行液組成及濃度可以獲得最佳的靈敏度和信噪比。異亮氨酸的pI=6.02,且在偏中性的介質(zhì)中易與Zn2+絡(luò)合穩(wěn)定而呈正電荷,因此選擇偏中性的電泳運(yùn)行溶液有利于電泳分離。實(shí)驗(yàn)考察了多種常用的電泳運(yùn)行液體系(乙酸- 乙酸鈉、磷酸- 磷酸鈉、硼酸- 硼酸鈉、三羥甲基氨基甲烷- 鹽酸和檸檬酸- 檸檬酸鈉等),結(jié)果表明:只有在檸檬酸- 檸檬酸鈉溶液體系中異亮氨酸對(duì)映體才可以獲得分離,且具有良好的檢測(cè)靈敏度。因此本實(shí)驗(yàn)最終確定的電泳運(yùn)行液體系為2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅(pH=7.3)。

考察了分離電壓(8～20 kV)對(duì)于分離效果的影響,結(jié)果表明:從8 kV開始,隨著分離電壓的增大,樣品峰的遷移時(shí)間逐漸縮短,半峰寬變小,對(duì)映體的分離度也隨之增加;當(dāng)達(dá)到13 kV時(shí),分離度(Rs)最佳;繼續(xù)增大分離電壓,則分離度開始變差。進(jìn)樣電壓較低和進(jìn)樣時(shí)間較短時(shí),進(jìn)樣量少,靈敏度低;當(dāng)進(jìn)樣電壓較大和進(jìn)樣時(shí)間較長時(shí),進(jìn)樣量大,靈敏度明顯提高,但會(huì)使進(jìn)樣量過多,導(dǎo)致電泳峰形展寬嚴(yán)重,從而降低了對(duì)映體的分離度。綜合考慮靈敏度、分離度、精密度和分析時(shí)間,選擇分離電壓為13 kV,進(jìn)樣電壓為11 kV,進(jìn)樣時(shí)間為8 s。

2.3 線性范圍、檢出限和精密度

在選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下,外消旋體的D,L- 異亮氨酸在8 min內(nèi)其對(duì)映體達(dá)到了良好的基線分離和靈敏檢測(cè)(見圖1,c(Zn2+)=2.0 mmol/L)。通過標(biāo)準(zhǔn)加入法確定D- 異亮氨酸出峰在前,L- 異亮氨酸出峰在后。單一構(gòu)型對(duì)映體的電泳峰面積與其質(zhì)量濃度在1.0～20 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,D型和L型異亮氨酸的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998 7和0.998 5,檢出限(S/N=3)為0.4 mg/L。進(jìn)行了日內(nèi)(intra- day)和日間(inter- day)精密度測(cè)定,以4 mg/L的L- 異亮氨酸為例平行測(cè)定6次,結(jié)果表明,遷移時(shí)間的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%和2.2% ,峰面積的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.2%和4.5% 。相同條件下,D- 異亮氨酸具有一致的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明本方法具有較高的檢測(cè)靈敏度和良好的重復(fù)性。

2.4 其他氨基酸的干擾試驗(yàn)

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,考察了其他19種常見氨基酸的干擾情況,結(jié)果表明這些氨基酸或是不出峰,或是其出峰時(shí)間與目標(biāo)電泳峰有差異,從而不干擾異亮氨酸對(duì)映體的測(cè)定。表明檸檬酸- Zn2+體系對(duì)異亮氨酸對(duì)映體的手性識(shí)別具有一定的專一性以及良好的抗干擾能力。

2.5 手性識(shí)別機(jī)理的初步探討

在文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道有金屬離子參與氨基酸對(duì)映體手性分離的CE方法中,金屬離子與L- 氨基酸的絡(luò)合物本身作為手性化合物添加到電泳運(yùn)行液中(溶液具有旋光性),氨基酸對(duì)映體在其構(gòu)建的手性環(huán)境中得以實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別。本文所采用的電泳運(yùn)行液(2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L檸檬酸+2.0 mmol/L乙酸鋅)屬于非手性介質(zhì)(溶液本身不具有旋光性),異亮氨酸對(duì)映體在上述電泳運(yùn)行液中得到拆分。因此,本文方法的手性識(shí)別機(jī)理完全有別于文獻(xiàn)報(bào)道的方法。為了闡明其手性識(shí)別機(jī)理,我們?cè)O(shè)計(jì)了多種不同的實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在保持電泳運(yùn)行液的pH和離子強(qiáng)度一致的前提下,用無機(jī)酸或是一元羧酸(如乙酸)替代檸檬酸,則無法實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的分離,說明檸檬酸除了提供電泳運(yùn)行液所需的H+外,還參與了手性識(shí)別過程。基于上述實(shí)驗(yàn)事實(shí),我們認(rèn)為Zn2+首先與具有三元羧酸結(jié)構(gòu)的檸檬酸可能形成具有“隱形”手性結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物,或可能形成一種類似于金屬有機(jī)物骨架結(jié)構(gòu)的化合物,然后再與D,L- 異亮氨酸對(duì)映體形成具有電泳淌度差別的結(jié)合物,從而實(shí)現(xiàn)手性分離。鑒于條件所限,更深層次的機(jī)理還在進(jìn)一步研究之中。

3 結(jié)論

本文的研究結(jié)果表明,采用CE- C4D在檸檬酸- Zn2+體系的電泳運(yùn)行液中可以實(shí)現(xiàn)異亮氨酸對(duì)映體的手性分離。因其手性識(shí)別機(jī)理具有特殊性,尚需采用多種手段,包括理論計(jì)算和表征技術(shù)對(duì)其手性識(shí)別機(jī)理進(jìn)行深入研究。本文的研究工作將為氨基酸對(duì)映體的手性識(shí)別提供一個(gè)新方法和新思路。

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