蘭 豐, 劉傳德

(山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)業(yè)部果品質量安全風險評估實驗室(煙臺), 山東 煙臺 265500)

單氰胺(cyanamide)又名氨基氰,分子式為CH2N2,主要作破眠劑使用,促進果樹提早萌芽、果實提前成熟上市。由于提前上市的水果市場競爭力強,近些年有關單氰胺用于設施栽培的櫻桃、葡萄、藍莓等果樹的研究越來越多[1-3]。然而,單氰胺對人體有一定的毒性,能引起接觸性皮炎、頭痛和惡心、嘔吐等胃腸道癥狀[4]。美國環(huán)境保護組織(EPA)[5]將單氰胺列為高毒Ⅰ類危險農(nóng)藥。2015年我國[6]啟動了果蔬植物生長調節(jié)劑使用調查與產(chǎn)品安全性評估研究,項目涉及的9種常用植物生長調節(jié)劑中包含單氰胺。我國[7]目前只規(guī)定了葡萄中單氰胺的最大殘留臨時限量值為0.05 mg/kg,其他作物未做規(guī)定,也沒有相關的標準檢測方法。

單氰胺極易溶于水,使用常規(guī)有機溶劑難以提取,相對分子質量小,濃縮過程易揮發(fā),無特征吸收峰,遇酸堿不穩(wěn)定,其殘留檢測極具挑戰(zhàn)性[8]。目前國內外關于單氰胺的殘留檢測方法較少,主要以柱前衍生間接測定為主。Rust[9]利用1,2- 萘醌- 4- 磺酸鉀為衍生試劑,測定植物中單氰胺的殘留。衍生前經(jīng)過兩步凈化處理:首先以硅藻土為固相分散劑,經(jīng)洗脫、濃縮后,再經(jīng)C18SPE柱凈化,衍生產(chǎn)物經(jīng)液相色譜紫外檢測器測定。Reddy等[10]利用CHEM ELUTM固相萃取柱萃取葡萄汁中的單氰胺,與1,2- 萘醌- 4- 磺酸衍生反應,液相色譜紫外檢測器測定。衍生前需要用100 mL正己烷預淋洗固相萃取柱,再用200 mL乙酸乙酯洗脫,衍生后用90 mL二氯甲烷萃取,整個前處理需要將近400 mL溶劑。張春濤[11]利用酸性氧化鋁為固相分散劑、丙酮作淋洗劑、丹磺酰氯(dansyl chloride, DNS)進行柱前衍生,測定葡萄和土壤中單氰胺的殘留量,以酸性氧化鋁添加石墨化炭黑作固相分散劑的凈化方式存在基質效應,而且人工填充柱子需要注意基質的松緊對結果的影響。Cheng等[12]采用多壁碳納米管凈化植物樣品提取液,利用DNS與單氰胺衍生后進行測定。每類植物樣品需要根據(jù)含水量多少確定加入提取溶劑的體積和凈化劑的量,比較繁瑣。柱前衍生法對樣品前處理要求十分嚴格,特別是衍生前凈化除雜步驟對衍生能否成功及試驗可重復性至關重要。在上述已報道的柱前衍生測定單氰胺方法中[9-12],有的前處理操作比較繁瑣,檢測效率不高,有的消耗試劑較多。本文著重考察了不同提取溶劑/體系對單氰胺的提取及衍生效果的影響,建立了單氰胺柱前衍生后直接進樣的檢測方法。DNS作為伯胺、仲胺、氨基酸、羥基化合物等衍生化使用最為廣泛的試劑,相關研究較多[13,14],在單氰胺衍生化檢測方面也有不少應用,比較成熟,本文主要借鑒了美國環(huán)境保護組織[15]公布的DNS衍生土壤中單氰胺的條件。在檢測器方面,優(yōu)先選擇靈敏度高、基質干擾小的液相色譜- 串聯(lián)質譜進行測定。所建立的DNS柱前衍生- 液相色譜- 串聯(lián)質譜測定單氰胺的方法,前處理簡便、有效,可用于批量檢測葡萄和櫻桃中單氰胺的殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC- MS 8040液相色譜- 串聯(lián)質譜儀(日本島津公司); SHA- B恒溫振蕩器、SK- 1快速混勻器(常州國華電器有限公司); RE- 52AA旋轉蒸發(fā)器(帶北京博醫(yī)康HX- 1050型恒溫循環(huán)器)(上海亞榮生化儀器廠); Milli- Q超純水系統(tǒng)(德國默克集團)。

甲酸(色譜級)購于上海阿拉丁試劑有限公司;丙酮(色譜純)和乙酸銨(優(yōu)級純)均購于天津市科密歐化學試劑有限公司;甲醇(質譜級)、DNS(純度≥98% )和單氰胺標準品(純度≥98% )均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 溶液的配制

2 g/L DNS衍生劑:稱取0.1 g DNS,用丙酮溶解定容至50 mL。

單氰胺標準工作溶液:將單氰胺標準品用乙腈配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/kg的單氰胺標準工作溶液。

單氰胺基質匹配標準溶液:用經(jīng)提取、濃縮、定容后獲得的葡萄和櫻桃空白基質溶液分別將單氰胺標準品配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/kg的單氰胺基質匹配標準溶液。

衍生緩沖液:4 mL 0.2 mol/L碳酸鈉水溶液和46 mL 0.2 mol/L碳酸氫鈉水溶液混合,用水定容至200 mL。

無水硫酸鈉:550 ℃烘烤4 h,于干燥器中保存。

1.3 實驗方法

1.3.1單氰胺標準品的衍生化

用移液槍分別移取200 μL系列單氰胺標準工作溶液,置于具塞試管中,分別加入0.5 mL衍生緩沖液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生劑,渦旋30 s后,置于50 ℃水浴中，并振蕩反應1 h,冷卻至室溫,用甲醇定容至2 mL,復溶后過0.45 μm尼龍濾膜。

1.3.2空白樣品的衍生化

取200 μL空白基質溶液,加入0.5 mL衍生緩沖液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生劑,按1.3.1節(jié)步驟進行衍生化。

1.3.3樣品衍生化

稱取4.0 g經(jīng)破壁機勻漿后的待測樣品,加入20 mL乙酸乙酯,超聲10 min,加入25 g無水硫酸鈉,持續(xù)渦旋1 min,經(jīng)濾紙過濾并用10 mL乙酸乙酯沖洗2次,所有濾液收集到100 mL具塞量筒中,最后轉移到50 mL雞心瓶中,于30 ℃水浴減壓蒸發(fā)濃縮近干,加丙酮定容至1 mL,得到待衍生液。取0.5 mL待衍生液,加入0.5 mL衍生緩沖液和0.5 mL 2 g/L DNS衍生劑,于50 ℃水浴中振蕩反應1 h,冷卻至室溫,用甲醇定容至2 mL,復溶后過0.45 μm尼龍濾膜。

1.3.4色譜和質譜條件

色譜柱:Shim- pack XR- ODS色譜柱(75 mm×2.0 mm, 1.6 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:1 μL。流動相A: 0.05%(體積分數(shù))甲酸+2 mmol/L醋酸銨,流動相B:甲醇;流速為0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.90 min, 10%B; 0.90～3.00 min, 10%B～50%B; 3.00～3.10 min, 50%B～70%B; 3.10～3.60 min, 70%B～95%B; 3.60～4.00 min, 95%B; 4.00～4.01 min, 95%B～10%B。目標化合物出峰時間為2.5 min左右。

質譜條件:ESI+電離模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式;DL(desolvation)管溫度為250 ℃;加熱模塊溫度為400 ℃;干燥氣流速為15 L/min；碰撞氣壓力為230 kPa。m/z276.0/156.1為定量離子對,m/z276.0/171.1為定性離子對。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑

單氰胺在43 ℃與水互溶,在水中有極高的溶解度,因此首先選擇水作提取劑。但試驗發(fā)現(xiàn)以水作提取劑存在兩方面不便:一方面,提取后不易濃縮,并且濃縮過程單氰胺先于水揮發(fā),易損失;另一方面,水可以提取出大量含氨基、酚羥基等能與DNS反應的極性化合物,不易除去,影響后續(xù)衍生。因此嘗試采用乙腈提取,經(jīng)鹽析后,取有機層衍生分析,單氰胺回收率低。其中大部分單氰胺可能仍在水層,加之有機層提取了很多與DNS反應的雜質,影響了衍生效果,從而影響回收率。

鑒于以乙腈和水作提取劑不利于后續(xù)的濃縮和衍生,不建議使用二者作提取溶劑。再者,植物源樣品含有的水對提取、濃縮不利,需予以去除。因此,本試驗選取沸點低、便于濃縮的丙酮、甲醇、乙酸乙酯和乙醚等對單氰胺有較高溶解度的溶劑作提取劑,并通過過量無水硫酸鈉除水,經(jīng)提取、濃縮與DNS衍生等步驟,考察單氰胺的回收率。結果表明,在丙酮、甲醇和乙醚3組試驗中,單氰胺回收率不足30% ,僅有乙酸乙酯組單氰胺回收率滿足農(nóng)殘檢測要求,具體回收率數(shù)據(jù)見表1。原因可能是乙酸乙酯相比其他3種溶劑提取的不利衍生的雜質較少,而DNS又過量,因此乙酸乙酯更適于作單氰胺的提取溶劑。

表1 葡萄基質中采用不同提取劑時單氰胺的回收率Table1 RecoveriesofcyanamideingrapematrixwithdifferentextractionsolventsTreatmentExtrationsolventRecovery/%Moistureretentionwater-acetonitrile20Moistureremovingacetone27methanol10ethylacetate75ether- -:nocyanamidederivativesweredetected.

2.2 方法學考察

2.2.1基質效應(ME)評判

為評價是否存在基質效應,對比了單氰胺標準溶液曲線與基質匹配標準溶液曲線。以單氰胺質量濃度(X, mg/L)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標得到線性方程。基質效應用ME=B/A×100%計算,A和B分別為單氰胺標準溶液曲線和基質匹配標準溶液曲線的斜率。一般情況下,ME在85% ～115%之間表示不存在明顯的基質效應,由此判斷,本檢測方法中單氰胺基質效應不明顯(見表2)。

表 2 單氰胺標準溶液與基質匹配標準溶液的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r2)和基質效應

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.2.2回收率、精密度和定量限

按0.01、0.05和1.0 mg/kg 3個添加水平向葡萄和櫻桃樣品中添加單氰胺,每個添加水平重復5次,并作空白對照。按本方法對樣品進行處理和測定,考察單氰胺的加標回收率,結果見表3。單氰胺在葡萄和櫻桃中的平均回收率為75% ～81% ,相對標準偏差為6.5% ～9.8% ?？梢娫摲椒ň哂休^高的回收率和較好的精密度,可以滿足葡萄和櫻桃中單氰胺殘留量檢測需要。根據(jù)添加回收試驗確定葡萄和櫻桃中單氰胺殘留檢測定量限均為0.01 mg/kg,相關譜圖見圖1。

表3 葡萄和櫻桃中單氰胺在3個添加水平下的回收率和相對標準偏差(n=5)Table3 RecoveriesandRSDsofcyanamideatthreespikedlevelsinthegrapesandcherries(n=5) FruitSpikedlevel/(mg/kg)Recovery/%RSD/%Grape0.01769.70.05769.81.0808.9Cherry0.01756.70.05817.01.0776.5

圖 1 空白樣品和加標樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the blank samples and the spiked samplesa. the blank sample; b. the sample spiked with 0.05 mg/kg cyanamide.

2.3 實際樣品測定

按所建立的方法對2016年抽取的山東濰坊、煙臺兩地的葡萄和櫻桃中單氰胺殘留量進行測定。20個櫻桃樣品(設施栽培)中有4個樣品檢出單氰胺殘留,殘留量為0.005～0.018 mg/kg。20個葡萄樣品未有單氰胺檢出。

3 結論

本研究利用過量無水硫酸鈉除水,乙酸乙酯提取,提取液經(jīng)濃縮后無需凈化可直接與DNS衍生反應,建立了液相色譜- 串聯(lián)質譜測定葡萄和櫻桃中單氰胺殘留的方法。免除了前處理過程的繁瑣操作,簡便、快速,可以滿足農(nóng)藥殘留檢測要求,可用于葡萄和櫻桃中單氰胺殘留批量檢測。同時,該方法中乙酸乙酯表現(xiàn)出來的優(yōu)勢也為研究DNS柱前衍生的科研工作者提供了有益參考。

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