周瑞澤, 周 雅, 毛 婷, 姜 潔

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心, 北京 100094)

廣義上來說,奶油包括天然奶油和人造奶油。天然奶油是以乳為原料加工而成的乳制品,根據(jù)含脂量的不同可分為稀奶油和黃油[1],同時(shí)含有蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2,3]。人造奶油指食用油脂加水和其他輔料乳化后,經(jīng)速冷捏和或不經(jīng)速冷捏和而制成的可塑性或流動(dòng)性的產(chǎn)品,其中的脂肪含量不低于80%[4],包含植脂奶油和人造黃油(又稱麥淇淋)。人造奶油有來源穩(wěn)定、原料成本低廉、用途與天然奶油相近的特點(diǎn)[5]。近年來,隨著我國經(jīng)濟(jì)增長和人們生活水平的提高,國內(nèi)對奶油的消費(fèi)量大幅增加。研究表明,人造奶油的制作中經(jīng)過氫化處理,會(huì)產(chǎn)生反式脂肪酸,從而對人體健康造成一定的危害[6,7]。由于不同種類的奶油以及同一種類但來源不同的奶油中所含脂肪酸種類、含量有一定差異[8,9],因此建立奶油中脂肪酸組成和含量的分析方法,獲取不同種類奶油的特征脂肪酸標(biāo)識(shí)物,對于確保奶油的質(zhì)量安全、減少奶油的摻假偽劣等都有重要意義。

目前有關(guān)奶油中脂肪酸組成檢測中常見的儀器分析方法有氣相色譜法[10]、氣相色譜- 質(zhì)譜法[11]、核磁共振法[12]、拉曼光譜法[13]、紅外光譜法[14]和分子熒光光譜法[15]等。這些方法常見于高含量脂肪酸成分的分析,但是由于奶油中脂肪成分復(fù)雜,且有許多脂肪酸的含量較低,使用上述方法較難對奶油中的所有脂肪酸做進(jìn)一步的鑒別區(qū)分。近年來發(fā)展的全二維氣相色譜- 質(zhì)譜(GC×GC- MS)技術(shù)具有峰容量大、靈敏度高、分離度好等特點(diǎn),已被廣泛運(yùn)用到復(fù)雜基質(zhì)成分分析等領(lǐng)域[16-19]。但采用GC×GC- MS進(jìn)行奶油中脂肪酸成分分析的研究未見報(bào)道。本研究建立了天然奶油和人造奶油中脂肪酸成分的GC×GC- MS定性定量分析方法,一些奶油中的微量脂肪酸成分也得到了識(shí)別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QP2010Ultra GC×GC- MS儀(日本島津公司) 配ZX1冷噴調(diào)制器(美國Zoex公司); 7890A氣相色譜儀配氫火焰離子檢測器(FID)、DB- 5毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)購自美國Agilent公司; BPX- 50毛細(xì)管氣相色譜柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm,美國SGE公司)。一維數(shù)據(jù)采集由GC- MS solution 4.2軟件完成,二維數(shù)據(jù)采集由GC Image R 2.5軟件完成。

37種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0% )購自美國NU- CHEK公司;甲苯、正己烷和甲醇(均為色譜級)購自美國Thermo Fisher公司;乙酰氯(色譜級)購自德國CNW公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

稀奶油、植脂奶油、黃油和麥淇淋均為市售商品。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1樣品制備

奶油中脂肪酸的衍生參考國標(biāo)方法[20]進(jìn)行,簡述如下:準(zhǔn)確稱取奶油試樣0.2 g于15 mL干燥螺口玻璃管中,加入5.0 mL甲苯和6 mL乙酰氯- 甲醇(1∶9,v/v)溶液,充氮?dú)夂笳袷幓旌?于(80±1) ℃水浴中放置2 h,期間每隔20 min取出振搖1次,水浴后取出冷卻至室溫。將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次,合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中,混勻,以5 000 r/min的速度離心5 min,取上清液作為試液待測。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品,用正己烷稀釋定容,儲(chǔ)存于-10 ℃以下冰箱。

1.3 儀器條件

1.3.1GC

色譜柱:HP- 88毛細(xì)管氣相色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm,美國Agilent公司);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:1μL;分流比:30∶1。升溫程序:130 ℃保持1 min,以6.5 ℃/min的速率升溫至170 ℃,然后以2.75 ℃/min的速率升溫至205 ℃,保持15 min,再以2.75 ℃/min的速率升溫至215 ℃,保持5 min,最終以4 ℃/min的速率升溫至230 ℃,保持6 min。FID溫度:270 ℃;氫氣流量:30 mL/min;空氣流量:300 mL/min。

1.3.2GC×GC- MS

氣相色譜參數(shù):一維色譜柱為DB- 5毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);二維色譜柱為BPX- 50毛細(xì)管氣相色譜柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm)。進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:1 μL;分流比:100∶1;恒線速度模式:80.8 cm/s。升溫程序:50 ℃保持2 min,以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃,然后以2.5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,再以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜參數(shù):掃描范圍為m/z40～385;電子轟擊(EI)源為70 eV;離子源溫度為200 ℃;傳輸線溫度為300 ℃;冷氣流量為6 L/min;熱氣溫度為350 ℃;調(diào)制周期為5 s;熱噴時(shí)間為400 ms;溶劑延遲時(shí)間為6 min。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 37種化合物的保留時(shí)間、基峰離子及特征離子

Retention I: retention time of the 1st dimensional chromatography; Retention II: retention time of the 2nd dimensional chromatography.

2 結(jié)果與討論

2.1 GC×GC- MS條件優(yōu)化

2.1.1載氣控制模式的選擇

色譜分離系統(tǒng)的第一維選用DB- 5型弱極性色譜柱,柱長為30 m,膜厚為0.25 μm;第二維選用BPX- 50型中等極性色譜柱,柱長為2.5 m,膜厚為0.1 μm,柱長與膜厚均比第一維色譜柱小很多,該柱系統(tǒng)可有效分離奶油中的脂肪酸。在此基礎(chǔ)上,比較了不同載氣控制模式(恒壓模式和恒線速度模式)的分離效果(見圖1)。結(jié)果表明,在15～28 min,恒線速度模式下C10～C15的脂肪酸甲酯分布更均勻;而在34～54 min, C18和C20類脂肪酸甲酯在恒線速度模式下分離效果更好。因此選擇恒線速度模式。

圖 1 不同載氣控制模式下37種化合物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 37 compounds in different carrier gas control modes

2.1.2升溫程序的優(yōu)化

選擇合適的柱溫是實(shí)現(xiàn)各種脂肪酸良好分離的關(guān)鍵。為保證目標(biāo)物從一維柱流出后能被有效切割3次以上,程序升溫的速率不能太大,一般為0.5～5 ℃/min[21]。由于奶油中的脂肪酸組成多大于8個(gè)碳原子,大部分均在180 ℃以后出峰,因此本試驗(yàn)選擇以較大的升溫速率10 ℃/min升至180 ℃,再以較小的速率2 ℃/min升溫,色譜條件如下:60 ℃始溫保持2 min,以10 ℃/min的速率升溫至180 ℃,保持2 min后再以2 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持10 min。結(jié)果顯示,雖然脂肪酸組分分離完全,但整個(gè)程序持續(xù)86 min,耗時(shí)太長(見圖2a)。由于37種脂肪酸的相對分子質(zhì)量、熔點(diǎn)和沸點(diǎn)分布范圍較廣,很難用簡單的升溫程序得到最佳分離效果。在確保分離度的前提下,通過仔細(xì)調(diào)節(jié)色譜柱升溫程序,發(fā)現(xiàn)多階升溫程序?qū)χ舅嵊泻芎玫姆蛛x效果。最終確定的升溫程序?yàn)?50 ℃始溫保持2 min,以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃,然后以2.5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,再以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持5 min。整個(gè)檢測過程僅需58 min,且奶油中的脂肪酸組成檢測完全,分離效果好,分布也更均勻(見圖2b)。

圖 2 不同升溫程序下37種化合物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 37 compounds with different temperature programs a. chromatography of 86 min: 60 ℃, held for 2 min; increased to 180 ℃ at 10 ℃/min, held for 2 min; increased to 300 ℃ at 2 ℃/min, held for 10 min; b. chromatography of 58 min: 50 ℃, held for 2 min; increased to 180 ℃ at 20 ℃/min, increased to 250 ℃ at 2.5 ℃/min; increased to 300 ℃ at 3 ℃/min, held for 5 min.

2.1.3調(diào)制解調(diào)器參數(shù)的優(yōu)化

調(diào)制解調(diào)器是二維色譜的核心部件,包含冷噴氣和熱噴氣。在二維色譜運(yùn)行過程中,冷噴氣持續(xù)釋放,熱噴氣脈沖式噴射,前后兩次熱噴之間的時(shí)間間隔稱為調(diào)制周期[22],每次熱噴氣釋放的時(shí)間稱為熱噴時(shí)間[23]。

本試驗(yàn)考察了不同調(diào)制周期(3、4、5和6 s)對分離度的影響。如圖3所示,調(diào)制周期對目標(biāo)物在二維色譜上的分離情況和信號(hào)強(qiáng)度有重要的影響,尤其是對同分異構(gòu)體化合物如亞油酸甲酯、反式亞油酸甲酯、γ- 亞麻酸甲酯、油酸甲酯和反式油酸甲酯。調(diào)制周期為3 s時(shí),γ- 亞麻酸甲酯和油酸甲酯被分割在多個(gè)調(diào)制周期,導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度降低;調(diào)制周期為6 s時(shí),5種化合物因保留時(shí)間超過調(diào)制周期導(dǎo)致共流出;調(diào)制周期為4和5 s時(shí),5種化合物二維譜圖輪廓清晰,分離效果好。另外,通過比較發(fā)現(xiàn)調(diào)制周期為5 s時(shí)的三維輪廓圖峰形較4 s時(shí)更好,目標(biāo)物基本不拖尾(見圖4)。

圖 4 不同調(diào)制周期的三維輪廓圖Fig. 4 Three dimensional profiles at different modulation periods

冷噴氣流量的大小與目標(biāo)物沸點(diǎn)有關(guān),對于C4～C40的化合物來說,其所需冷氣量隨碳數(shù)增加逐漸降低,一般為15.5～1.5 L/min[24]。通過觀察本研究中的目標(biāo)物在不同冷氣流量條件下的一維色譜峰是否被切開,確定冷氣流量為6 L/min。

考察發(fā)現(xiàn)熱噴時(shí)間(350、400和450 ms)的加大并不能明顯改善分離效果,信號(hào)強(qiáng)度雖有所增大,但仍在同一數(shù)量級,因此選擇400 ms的熱噴時(shí)間。

2.1.4掃描范圍的確定

由于二維色譜峰峰形較窄,為提高分析靈敏度及定性定量的準(zhǔn)確度,需要選擇盡量窄的質(zhì)譜掃描范圍。由于丁酸、己酸、辛酸和癸酸等低碳數(shù)脂肪酸屬于奶油中的重要風(fēng)味化合物,且質(zhì)荷比41和43的碎片離子為脂肪酸甲酯的常見碎片離子,為保證譜圖的完整性,起始掃描質(zhì)荷比設(shè)為40。而本研究考察的37種脂肪酸化合物中相對分子質(zhì)量最大的為C24∶0,其甲酯化合物分子離子峰的質(zhì)荷比為382,因此選擇385作為掃描的最大質(zhì)荷比。各化合物的保留時(shí)間及特征離子見表1。

2.2 靈敏度的考察

圖 5 月桂酸甲酯在(a)GC- FID和(b)GC×GC- MS上的靈敏度Fig. 5 Sensitivities of C12∶0 by (a) GC- FID and (b) GC×GC- MS

本研究比較了優(yōu)化條件下脂肪酸甲酯在二維色譜GC×GC- MS和傳統(tǒng)一維色譜GC- FID上靈敏度的差異(見圖5)。其中圖5a為月桂酸甲酯在一維色譜上的響應(yīng)情況,圖5b為月桂酸甲酯在二維色譜上的響應(yīng)情況。月桂酸甲酯在二維色譜上被調(diào)制成3個(gè)碎片峰,其信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度比一維色譜提高了10倍以上,信噪比比一維色譜提高了90倍以上,該結(jié)果與文獻(xiàn)[22]報(bào)道吻合。

2.3 定性和定量分析方法

本研究中37種脂肪酸化合物的定性分析主要通過將混合標(biāo)準(zhǔn)品的全掃描二維譜圖中各峰點(diǎn)質(zhì)譜圖導(dǎo)入NIST譜庫檢索而實(shí)現(xiàn);對于譜圖相近、無法識(shí)別的同分異構(gòu)體則通過單一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣的方式進(jìn)行判定。結(jié)果表明,所有化合物都得到了較好的分離,未發(fā)現(xiàn)在二維色譜上出現(xiàn)重組的現(xiàn)象;各化合物的色譜保留時(shí)間規(guī)律與質(zhì)譜特征也與吳惠勤等[25]的描述一致。由于本研究旨在確定不同奶油中脂肪酸組成的差異,考慮到脂肪酸同系物的響應(yīng)值相近,可用面積歸一化定量法測定各脂肪酸的相對含量來表示其含量。

2.4 實(shí)際樣品分析

選取包括稀奶油、植脂奶油、黃油和麥淇淋的4種奶油樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2。由表2可知,天然奶油與人造奶油所含脂肪酸組成差異顯著。稀奶油、黃油及植脂奶油均以飽和脂肪酸為主,含量分別為51.72% ～98.96% ;其中植脂奶油的總飽和脂肪酸含量最高,為98.63% ～98.96% 。而麥淇淋則以不飽和脂肪酸為主,總含量為59.55% ～69.61% ;其中單不飽和脂肪酸總含量低于多不飽和脂肪酸總含量。

表 2 不同樣品中脂肪酸的含量

ND: not detected.

天然奶油以牛乳脂為主要原料,其脂肪酸組成與牛乳相似,含有丁酸、己酸、辛酸、癸酸等特征碳鏈脂肪酸[26],也包括本文檢出的肉豆蔻油酸、十五碳一烯酸、十七碳一烯酸等微量脂肪酸,這類風(fēng)味物質(zhì)可用于區(qū)別人造奶油。即便同為天然奶油,稀奶油和黃油因其原料乳受牧草生長、飼料來源、奶牛年齡和泌乳期的影響[27],脂肪酸組成也不盡相同。植脂奶油多以氫化棕櫚仁油為原料,其脂肪酸以飽和脂肪酸為主,常見的不飽和脂肪酸如十八碳烯酸、二十碳烯酸和二十二碳烯酸基本未檢出,而高含量的肉豆蔻酸和硬脂酸可作為特征組成的依據(jù);說明植脂奶油在制備過程中,增加了飽和脂肪酸的含量,該結(jié)果與加工工藝吻合[9]。麥淇淋則是以植物油為主要原料的人造奶油,其脂肪酸組成與植物油類似,一般為10～22碳脂肪酸[28],且不飽和脂肪酸含量較高。與其他奶油相比,麥淇淋中的亞油酸和花生酸的相對含量較高,十四碳以下脂肪酸的含量最少,該結(jié)果與文獻(xiàn)描述相近[29]。

3 結(jié)論

本文建立了GC×GC- MS分析奶油中脂肪酸組成的方法,實(shí)現(xiàn)了食品復(fù)雜基質(zhì)中脂肪酸的有效分離和準(zhǔn)確認(rèn)定。相較于傳統(tǒng)的GC- FID法,本方法定性更準(zhǔn)確,有助于根據(jù)脂肪酸種類及含量的不同進(jìn)一步區(qū)分天然奶油和人造奶油。將本方法應(yīng)用到市售奶油樣品的檢測中,其中常規(guī)脂肪酸的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致,而且檢出成分更豐富,為今后奶油品質(zhì)評價(jià)、摻假鑒別等食品安全保障工作提供了有力的技術(shù)支撐。

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