鄭雪芳, 陳德局, 陳小強, 劉 波, 朱育菁

(福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003)

青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)易引起作物青枯病,該病是一種毀滅性土傳病害[1]。青枯病是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴重的植物病害之一,堪稱“植物癌癥”,一旦發(fā)病就難以控制[2]。利用無致病力的青枯雷爾氏菌防治作物青枯病具有很好的應用潛力[3-9]。Frey等[4]、楊宇紅等[5]和Hanemian等[6]用無致病力的青枯雷爾氏菌hrp- 突變體防治茄科蔬菜青枯病，并取得了良好的防治效果；Trigalet和Trigalet- Demery[7]、程本亮等[8]利用轉座子Tn5插入誘變獲得的青枯雷爾氏菌無致病力菌株，發(fā)現(xiàn)其對番茄青枯病具有良好的防病、控病效果；肖田等[9]從田間分離到116株青枯雷爾氏菌的無致病力菌株，其中有2株具有較好的溫室控病效果，20 d后的相對防效分別為58.4%和97%。 然而,作者通過分離篩選自然弱毒株、60Co輻射誘變和EZ- Tn5插入誘變等途徑獲得的55株青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株對番茄青枯病的防效差異較大(8.3% ～100% ),可能與青枯雷爾氏菌在自然狀態(tài)下致病力分化嚴重、存在不同致病力菌株混雜的現(xiàn)象有關[3]。

青枯雷爾氏菌在致病力分化過程中會引起細胞表面特性的相應改變[10]。細菌細胞表面覆蓋有多糖類、脂類、蛋白質(zhì)、肽聚糖等物質(zhì),在不同條件下,這些物質(zhì)的電離狀態(tài)不同,從而使細菌表面帶上不同的電荷[11],因此可通過高效離子交換色譜將帶不同電荷的細菌分離。Daniels[12]利用強陰離子交換樹脂,通過控制緩沖液pH值和離子強度,成功地將6種不同的細菌進行分離;Marquis等[13]利用陽離子交換樹脂實現(xiàn)對不同細菌的色譜分離;林娟等[10]、Zheng等[14]以強陰離子交換樹脂為介質(zhì),利用高效離子交換色譜(high performance ion- exchange chromatography,HPIEC)成功實現(xiàn)了不同致病力青枯雷爾氏菌的快速分離;鄭雪芳等[15]對分析青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分離條件進行優(yōu)化,縮短了分離時間(15 min),提高了分離效率。

研究表明,胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)在青枯菌的致病過程中起著十分重要的作用,是主要的致病因素[16,17]。EPS通過堵塞寄主維管束,干擾營養(yǎng)和水分的運輸,最終導致植株萎蔫死亡[18-20]。胞外多糖缺失突變體則失去對寄主的致病力[16]。胞外多糖受epsA、epsB、epsC、epsD、epsE和epsF基因簇控制[21]。作者前期利用基因敲除技術,將青枯雷爾氏菌強致病力菌株FJAT- 91的epsD基因進行敲除,獲得1株無致病力突變菌株FJAT- 91⊿epsD,室內(nèi)盆栽試驗表明該菌株具有良好的定殖能力和防治效果。本研究在此基礎上,比較分析了無致病力突變菌株FJAT- 91⊿epsD與出發(fā)菌株FJAT- 91及自然致弱的無致病力菌株FJAT- 1458在菌落和菌體形態(tài)及胞外多糖含量上的異質(zhì)性,進而利用高效離子交換色譜分離這3個菌株,從峰形和保留時間上分析不同菌株的色譜行為差異,為利用菌株FJAT- 91⊿epsD研發(fā)生防制劑提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀(HPLC1100,美國Agilent公司);紫外- 可見分光光度計(UV- 2550,日本島津公司);透射電鏡(HT7700,日本日立公司);高速冷凍離心機(Eppendorf 5418R,德國Eppendorf公司);熒光體視顯微鏡(M165FC,德國Leica公司);恒溫培養(yǎng)箱(BI- 250AG,上海施都凱儀器設備有限公司)。

青枯雷爾氏菌強致病力菌株FJAT- 91分離自番茄青枯病株;青枯雷爾氏菌自然致弱的無致病力菌株FJAT- 1458(作為參比菌株)分離自番茄青枯病田塊的健康植株;青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株FJAT- 91⊿epsD是以FJAT- 91為出發(fā)菌株,利用基因敲除技術對其epsD基因進行敲除獲得,以上菌株均由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫收集并保存。供試的番茄品種為農(nóng)科180,購自福建省農(nóng)科農(nóng)業(yè)良種開發(fā)有限公司。青枯雷爾氏菌的固體培養(yǎng)基為2,3,5- 氯化三苯基四氮唑(2,3,5- triphenyltetrazolium chloride, TTC)培養(yǎng)基[22],成分為蛋白胨10.0 g、水解酪蛋白1.0 g、葡萄糖5.0 g、瓊脂粉18.0 g, 0.5 g 2,3,5- 氯化三苯基四氮唑,用蒸餾水溶解,調(diào)節(jié)pH值為7.2,定容至1 L;液體培養(yǎng)基為蔗糖蛋白胨(sucrose peptone, SP)培養(yǎng)基,成分為蔗糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO40.5 g和MgSO40.25 g,用蒸餾水溶解,調(diào)節(jié)pH值為7.2,定容至1 L。青枯雷爾氏菌高效離子交換色譜分離所需的平衡緩沖液(A液): 0.02 mol/L哌嗪- HCl;洗脫緩沖液(B液): 0.02 mol/L哌嗪- HCl+1 mol/L NaCl。

1.2 實驗方法

1.2.1青枯雷爾氏菌epsD突變菌株的形態(tài)鑒別

菌落形態(tài):出發(fā)菌株FJAT- 91、突變菌株FJAT- 91⊿epsD及自然致弱的無致病力菌株FJAT- 1458接種在TTC培養(yǎng)基上,于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài)并拍照。

菌體形態(tài):將上述活化好的各菌株,挑取單菌落,轉接于SP液體培養(yǎng)基,于30 ℃以180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,分別吸取2 μL菌液至銅網(wǎng),靜置2 min,用濾紙吸干,然后用2%(質(zhì)量分數(shù))的磷鎢酸染色30 s,自然晾干,于透射電鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照。

1.2.2青枯雷爾氏菌epsD突變菌株的胞外多糖含量測定

采用苯酚- 硫酸法測定胞外多糖的含量,具體方法參照文獻[8]。

1.2.3細菌培養(yǎng)及樣品制備

青枯雷爾氏菌強致病力菌株FJAT- 91和突變菌株FJAT- 91⊿epsD經(jīng)TTC培養(yǎng)基活化后,轉接于SP液體培養(yǎng)基,于30 ℃以180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h。取2 mL菌液于4 ℃以8 000 r/min離心5 min,去上清液,用超純水洗滌沉淀物2次,然后用無菌水重懸,調(diào)至菌體細胞含量為1.0×109CFU/mL,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4色譜條件

色譜系統(tǒng)的前處理:為了保證細菌的色譜分離過程處于無菌環(huán)境,在進樣前,依次用0.1 mol/L的NaOH溶液、75%(v/v)的乙醇水溶液和無菌水各沖洗15 min,最后用無菌的緩沖液A平衡色譜系統(tǒng)。實驗所用的所有器皿均需經(jīng)過高壓滅菌處理,緩沖液用超純水配制,使用前用0.22 μm的醋酸纖維素膜過濾。上樣的樣品前處理也嚴格按照無菌操作進行。

色譜分離及檢測:將制備的細胞樣品注入色譜分離系統(tǒng),進樣量為20 μL,采用Toyopearl Tskgel SuperQ- 650C強陰離子交換樹脂填充色譜柱(200 mm×4.6 mm),流速2 mL/min,泵壓0.8 MPa,柱溫25 ℃。樣品上樣后,用A液平衡0～3 min,使樣品充分吸附到強陰離子交換樹脂上;3～8 min時,進行線性梯度洗脫,梯度為100% ～25%的A液;8～12 min時,轉換為100%B液,將樹脂上的殘余細菌全部洗出;12～15 min時,用A液平衡系統(tǒng)。樣品經(jīng)上述洗脫后,采用紫外檢測器檢測,檢測波長為260 nm。

1.2.5回收率及致病力鑒定

將高效離子交換色譜分離的菌株FJAT- 91、FJAT- 91⊿epsD和FJAT- 1458的色譜峰回收,用無菌水按10-1、10-2、10-3等系列梯度稀釋后涂布于TTC培養(yǎng)基,于30 ℃培養(yǎng)48 h。(1)隨機選取TTC平板上的10個單菌落,在熒光體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài),并測量和計算弱化指數(shù)(attenuation index, AI)[23]。(2)挑取單菌落轉接至SP液體培養(yǎng)基,于30 ℃以180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h,菌液稀釋至108CFU/mL,傷根接種于5～6葉齡的番茄盆栽苗(4株/盆),無菌的SP培養(yǎng)基為陰性對照,接種量為80 mL/盆,每種色譜峰回收的菌株分別接種處理15盆,重復3次,每天觀察植株發(fā)病情況。植株發(fā)病率計算公式如下:發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用不同方法處理的番茄植株的發(fā)病率及其方差均采用DPS7.05統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 青枯雷爾氏菌epsD突變菌株的形態(tài)特征

圖 1 青枯雷爾氏菌(a)強致病力菌株FJAT- 91、(b)無 致病力突變菌株FJAT- 91⊿epsD和(c)無致病力菌株FJAT- 1458的菌落形態(tài) Fig. 1 Colony morphologies of Ralstonia solanacearum (a) virulent strain FJAT- 91, (b) avirulent mutant FJAT- 91⊿epsD and (c) avirulent strain FJAT- 1458

Zheng等[14]、劉波等[23]根據(jù)青枯雷爾氏菌在TTC選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征,將其分為3種致病力類型:強致病力、無致病力和過渡型。強致病力菌株的菌落呈現(xiàn)圓形或近圓形,菌落表面濕潤,流動性強,中間為粉紅色,白邊寬;無致病力菌株的菌落為圓形,菌落表面干燥,無流動性,中間為暗紅色,白邊窄;過渡型菌株菌落為圓形,菌落表面濕潤,中間為暗紅色,白邊比較窄。本研究中菌株FJAT- 91的菌落形態(tài)符合強致病力菌株的形態(tài)特征(見圖1a);突變菌株FJAT- 91⊿epsD的菌落形態(tài)(見圖1b)與菌株FJAT- 1458的菌落形態(tài)(見圖1c)相似,表現(xiàn)為無致病力菌株菌落形態(tài)的典型特征,即菌落表面干燥,無流動性,白邊窄或無白邊。

圖 2 青枯雷爾氏菌(a)強致病力菌株FJAT- 91、(b)無 致病力突變菌株FJAT- 91⊿epsD和(c)無致病力菌株FJAT- 1458的菌體形態(tài) Fig. 2 Cell morphologies of Ralstonia solanacearum in (a) virulent strain FJAT- 91, (b) avirulent mutant FJAT- 91⊿epsD and (c) avirulent strain FJAT- 1458

菌株FJAT- 91的菌體細胞為短桿狀,大小為(0.60～0.85) μm×(0.90～1.72) μm,寬長比值為0.30～0.61,細胞顏色較深(見圖2a);菌株FJAT- 91⊿epsD細胞大小為(0.56～0.84) μm×(1.40～1.87) μm,寬長比值為0.36～0.48,細胞顏色較淺,邊緣呈透明狀(見圖2b);菌株FJAT- 1458細胞大小為(0.59～0.68) μm×(1.09～1.75) μm,寬長比值為0.32～0.67,細胞顏色淺,部分細胞邊緣呈透明狀(見圖2c)。這可能是因為強致病力菌株含有大量的EPS,而無致病力菌株中的EPS含量較低,據(jù)報道[24]青枯雷爾氏菌分泌的EPS中有15%會黏附在細胞表面,EPS與磷鎢酸染色劑的親和力強,形成的電子密度高,因此在透射電鏡下呈現(xiàn)的菌體細胞顏色較深。

2.2 胞外多糖含量測定結果

EPS是青枯雷爾氏菌的主要致病原因[25],青枯雷爾氏菌細胞表面黏附的EPS含量越高，其致病性越強[10]。本研究供試的3株菌株中,菌株FJAT- 91的EPS含量最高，為(30.49±2.97) μg/mL；菌株FJAT- 91⊿epsD的EPS含量顯著降低,為(12.64±1.46) μg/mL,比菌株FJAT- 91降低了58.54% ,與菌株FJAT- 1458的EPS含量((11.30±1.38) μg/mL)相當。

圖 3 青枯雷爾氏菌(a)無致病力菌株FJAT- 1458、 (b)無致病力突變株FJAT- 91⊿epsD和(c)強致病力菌株FJAT- 91的色譜圖 Fig. 3 Chromatograms of Ralstonia solanacearum in (a) avirulent strain FJAT- 1458, (b) avirulent mutant FJAT- 91⊿epsD and (c) virulent strain FJAT- 91

2.3 高效離子交換色譜分離

由圖3可知，青枯雷爾氏菌菌株FJAT- 91、菌株FJAT- 91⊿epsD和菌株FJAT- 1458的色譜行為有明顯的差異。菌株FJAT- 1458經(jīng)高效離子交換色譜分離為單個色譜峰,命名為P1峰(見圖3a),保留時間為0.59 min;菌株FJAT- 91⊿epsD經(jīng)高效離子交換色譜分離,除P1峰外,在保留時間為4.62 min處形成另一個色譜峰P2(見圖3b);菌株FJAT- 91則在保留時間為6.04 min處形成單一色譜峰P3(見圖3c)。林娟等[10]認為青枯雷爾氏菌強致病力菌株的色譜峰保留時間長,與其EPS含量高有關,EPS的存在會增加菌體細胞表面的電負性,EPS含量越高,細胞表面攜帶的負電荷越多,與陰離子交換樹脂的結合力就越強,色譜峰的保留時間就越長，本研究結果與此相吻合,強致病力菌株FJAT- 91的色譜峰保留時間明顯長于無致病力的菌株FJAT- 1458和FJAT- 91⊿epsD的保留時間。

2.4 不同菌株致病力的鑒定

劉波等[23]用弱化指數(shù)作為青枯雷爾氏菌致病力的量化指標,弱化指數(shù)是指菌落的紅斑直徑與菌落直徑的比值,弱化指數(shù)小于0.65為強致病力菌株,弱化指數(shù)大于0.75為無致病力菌株,弱化指數(shù)介于0.65與0.75之間為過渡型菌株。將菌株FJAT- 91的色譜峰P3、菌株FJAT- 91⊿epsD的色譜峰P1和P2及菌株FJAT- 1458的色譜峰P1進行回收,在TTC培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,呈現(xiàn)典型的青枯雷爾氏菌菌落形態(tài)(見圖4), P1峰回收后的菌株FJAT- 1458- P1(見圖4a)和FJAT- 91⊿epsD- P1(圖4b)的菌落形態(tài)與菌株FJAT- 91⊿epsD(圖1b)和FJAT- 1458(圖1c)的菌落形態(tài)相同,P3峰回收后菌株FJAT- 91- P3的菌落形態(tài)(圖4d)與菌株FJAT- 91(圖1a)的菌落形態(tài)相同。

弱化指數(shù)測定結果表明,菌株FJAT- 91⊿epsD- P1的弱化指數(shù)為0.87±0.12,與菌株FJAT- 1458- P1弱化指數(shù)(0.87±0.13)相當,鑒定為無致病力;菌株FJAT- 91⊿epsD- P2的弱化指數(shù)為0.70±0.07,鑒定為過渡型;菌株FJAT- 91- P3的弱化指數(shù)為0.58±0.02,鑒定為強致病力。

經(jīng)番茄盆栽苗接種試驗,菌株FJAT- 91- P3致病力最強,接種后4 d植株開始發(fā)病,接種后10 d發(fā)病率達100% ;菌株FJAT- 91⊿epsD- P2在接種9 d后植株開始發(fā)病,接種10 d后發(fā)病率為11.67% ;菌株FJAT- 91⊿epsD- P1和菌株FJAT- 1458- P1接種番茄不引起番茄植株發(fā)病,接種20 d后番茄植株發(fā)病率為0,而此時接種菌株FJAT- 91⊿epsD- P2和菌株FJAT- 91- P3的番茄植株發(fā)病率為100%(見表1)。

圖 4 不同色譜峰回收菌株的菌落形態(tài)Fig. 4 Colony morphologies of strains eluted from different chromatographic peaksa. FJAT- 1458- P1; b. FJAT- 91⊿epsD- P1; c. FJAT- 91⊿epsD- P2; d. FJAT- 91- P3.

StrainDiseaseincidence(mean±SD)/%4d5d6d7d8d9d10d20dFJAT-1458-P1000000 0 0FJAT-⊿epsD-P1000000 0 0FJAT-⊿epsD-P2000003.67±1.1511.67±1.53100.00±0FJAT-91-P35.33±0.5817.00±2.6533.00±3.0065.00±1.7375.00±5.0086.33±3.51100.00±0100.00±0

3 結論

本研究從形態(tài)、生理、色譜行為等方面,比較分析了青枯雷爾氏菌epsD基因敲除后獲得的無致病力突變菌株FJAT- 91⊿epsD與出發(fā)菌株強致病力青枯雷爾氏菌FJAT- 91及自然致弱的無致病力菌株FJAT- 1458的差異性。研究結果可為菌株FJAT- 91⊿epsD的生防應用提供理論依據(jù)。

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