代 靜 , 焦 雪 , 盧玉婷 , 張培軍 , 巴翠玉 , 茆安婷 , 李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ; 2.吉林省衛(wèi)生檢測(cè)檢驗(yàn)中心 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

魚傳染性造血器官壞死病(Infectious hematopoietic necrosis of fish, IHN)是由傳染性造血器官壞死病病毒(InfectioushematopoieticnecrosisVirus, IHNV)引起的一種急性的、全身性的魚類傳染病[1]，20世紀(jì)50年代初，該病毒在北美洲西部大馬哈魚魚苗場(chǎng)首次被發(fā)現(xiàn)[2]，迅速蔓延到歐洲和亞洲，在鮭類和鱒類魚中引起了全球流行病[3]。IHNV-G蛋白是能夠誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)的惟一病毒蛋白[4]。發(fā)病時(shí)以魚體出血，腎臟和脾臟造血組織壞死為典型特征，IHN的感染造成成魚死亡率為10%～25%，幼魚死亡率可達(dá)100%[5]。因此研制其免疫效果好、安全性高、成本低廉的新型疫苗成為研究的熱點(diǎn)。

目前，對(duì)IHNV有效的防控措施是通過隔離病毒或是注射疫苗，但3月齡內(nèi)的魚苗其免疫器官未發(fā)育成熟[6]，所以注射疫苗往往達(dá)不到理想的效果。萊茵衣藻作為光合真核微生物，可準(zhǔn)確表達(dá)外源基因，生物安全性高，近年來發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻具有外泌蛋白的能力，可大大降低重組蛋白的后續(xù)分離純化。利用其作為生物反應(yīng)器研制魚類口服疫苗具有良好的應(yīng)用前景[7-8]。本研究主要以研制出安全、可靠的新型載體口服疫苗為目的，為我國的冷水漁業(yè)健康發(fā)展提供一定的技術(shù)支持[9]。本試驗(yàn)將傳染性造血器官壞死病病毒主要抗原組分糖蛋白基因重組到萊茵衣藻核表達(dá)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用電穿孔技術(shù)將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻中，進(jìn)行抗性篩選，以獲得攜帶了目的基因的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。同時(shí)，將重組的萊茵衣藻灌喂BALB/c小鼠后進(jìn)行IHNV安全評(píng)價(jià)，獲得小鼠脾臟細(xì)胞后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫指標(biāo)。從而為研制新型、安全有效的IHNV口服疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 IHNV-G基因總RNA的提取 取300 μL細(xì)胞毒加1 mL TRIZol室溫孵育5 min，12 000 r/min (4 ℃)離心15 min后吸取上清，加入200 μL的氯仿震蕩15 s，室溫孵育5 min；12 000 r/min(4 ℃)離心15 min；吸取上層轉(zhuǎn)置到一個(gè)新的EP管中，加入500 μL的異丙醇沉淀RNA，室溫孵育10 min；12 000 r/min(4 ℃)離心15 min；倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌2次，7 500 r/min(4 ℃)離心5 min；室溫干燥5 min，加25 μL的無RNA酶處理水溶解并保存在-80 ℃。

1.2 IHNV-G基因cDNA的克隆 以1μL細(xì)胞為模板，按照寶生生物(上海)公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公開IHNV的HLJ-09株(登錄號(hào)：JX649101)的G基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，去掉終止密碼子后在上游引物中引入EcoRI酶切位點(diǎn)和下游引物中引入KpnI酶切位點(diǎn)：上游引物：5′-TAGATATCATGGACGCCATGATCAC-3′；下游引物:5′-ATGGTACCTATTAGGACCTGTTTGCC-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性5 min；退火溫度61 Tm；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，按寶生生物(上海)公司提供的膠回收試劑盒進(jìn)行純化，連接至DH5α中，挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，按照質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取，用EcoRI酶、KpnI酶進(jìn)行雙酶切，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 重組萊茵衣藻的構(gòu)建 將擴(kuò)增得到的IHNV-G基因克隆到pMD18T中，然后將其涂布與LB培養(yǎng)基中，隔天挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基中振蕩過夜，按北京索萊寶生物技術(shù)有限公司小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒并送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測(cè)序，然后將測(cè)序正確的質(zhì)?？寺〉絧DBle載體上構(gòu)建PDBle-IHNV-G重組表達(dá)載體，經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻中，通過博來霉素抗性篩選得到單克隆轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。

1.4 IHNV-G蛋白血清的制備 抗IHNV全血清病毒的制備，取本實(shí)驗(yàn)室保存的IHNV細(xì)胞毒15 mL，按照2.5 μL/mL加入40%甲醛至終濃度0.1%，37 ℃溫育48 h。加入等體積的弗氏佐劑混勻，采用腹腔注射，每只小鼠注射0.25 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，每只小鼠眼球取血約0.7 mL，37 ℃水浴1 h，3 000 r/min(4 ℃)離心10 min，最后血清量約350 μL左右置于-20 ℃保存。

1.5 Westen Blot 將重組的萊茵衣藻表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后用蒸餾水沖洗3次，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5 min準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，做好標(biāo)記，用PBS沖洗3次，置于5 %脫脂奶中，4 ℃封閉過夜；次日，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5 min，在加入1∶3 000稀釋濃度的鼠源HIS標(biāo)簽抗體作為首抗，室溫孵育5 h；TBST漂洗3次，每次5 min；加入1∶2 000稀釋濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗鼠IgG作為二抗，37 ℃孵育1.5 h；TBST漂洗3次，每次5 min。按照DAB顯示試劑盒進(jìn)行顯色，顯色前將10 mL反應(yīng)液，200 μL溶液A，100 μL溶液B，20 μL溶液C在棕色瓶中充分混勻，再將PVDF膜浸泡在其中，37 ℃條件下震蕩反應(yīng)5 min，棄去顯色液后用蒸餾水沖洗3次，自然干燥后觀察記錄。

1.6 病毒滴度的測(cè)定 按照每cm2最多加入10 μL IHNV病毒的標(biāo)準(zhǔn)將本實(shí)驗(yàn)室保存的IHNV病毒加入FHM單層細(xì)胞中，16 ℃吸附1 h后換新鮮的M199培養(yǎng)基，置于16 ℃培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每天記錄觀察。待80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，制備病毒懸液備用，進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定，TCID50計(jì)算采用Karber 法計(jì)算，即LgTCID50=L-d(s-0.5)，L是最高稀釋度的對(duì)數(shù)，d是稀釋度對(duì)數(shù)之差，s是陽性孔比率總和。

1.7 BALB/c小鼠的飼養(yǎng) 取6周齡雌性BALB/c小鼠，將小鼠分為4組，每組10只，飼喂同樣的鼠糧和水。每日灌胃1次，一次200 μL,第1組灌喂轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，第2組灌喂萊茵衣藻，第3組、第4組灌喂PBS，連續(xù)灌喂7 d，每日觀察并記錄小鼠狀態(tài)。

灌胃結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，第1、2、3組每只小鼠腹腔注射IHNV病毒200 μL，第4組小鼠腹腔注射PBS 200 μL，每日觀察并記錄小鼠狀態(tài)。第0、7、14、21、28天，隨機(jī)選取4只小鼠稱重，取平均值。每日觀察并記錄小鼠狀態(tài)。

1.8 小鼠脾臟細(xì)胞的制備與淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 第14天每組隨機(jī)取4只小鼠，在無菌條件下取小鼠脾臟。在脾臟組織中加1 mL M199細(xì)胞培養(yǎng)基，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾于離心管中，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，加入500 μL紅細(xì)胞裂解液重懸脾細(xì)胞，避光裂解10 min，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，觀察細(xì)胞沉淀，如果仍然為紅的，重復(fù)裂解1次；如果細(xì)胞沉淀為白色，加入1 mL M199培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞沉淀，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，加 1 mL FACS溶液洗滌細(xì)胞沉淀，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min；棄上清，加入1mL FACS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；分裝細(xì)胞，每管1×106細(xì)胞；在加入1 mL FACS洗滌1次，2 000 r/min(4 ℃)離心5 min，加入100 μL FACS即為脾細(xì)胞懸液。

取上述制備的脾臟細(xì)胞，每管加入抗小鼠PE-CD3e、FITC-CD4、APC-CD8a單克隆抗體各10 μL，同時(shí)設(shè)置單染對(duì)照組和空白對(duì)照組，室溫避光孵育50 min，然后用FACS沖洗多余抗體，避免影響檢測(cè)結(jié)果，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光，并用軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 IHNV-G基因總RNA提取結(jié)果 待80%細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，按照TRIZol試劑說明書操作提取細(xì)胞毒中FHM細(xì)胞和IHNV病毒的總RNA如圖1。

圖1 FHM細(xì)胞和IHNV病毒的總RNA

2.2 IHNV-G基因RT-PCR擴(kuò)增 以FHM細(xì)胞和IHNV病毒的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。再以cDNA作為PCR反應(yīng)的模板，經(jīng)特異性引物PCR反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖2，得到一條1 500 bp左右大小的特異性條帶。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-2 000 Marker； 1和2均為IHNV PCR產(chǎn)物

2.3 萊茵衣藻表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果 將表達(dá)載體化學(xué)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果如圖3，得到1條1 500 bp 左右大小的特異性條帶，說明線性化載體與目的片段連接成功，將質(zhì)粒送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果同樣證明載體與目的片段連接成功，插入片段進(jìn)行同源性比對(duì)結(jié)果同源性為99%。

圖3 表達(dá)載體pCh-IHNV-G 酶切結(jié)果

M:250 bp DNA Marker ; 1、3、5：pCh-IHNV-G表達(dá)載體藻;2、4、6：質(zhì)粒酶切

2.4 SDS-PAGE電泳分析結(jié)果 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻經(jīng)兩次抗性篩選后，離心收集轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，超聲波破碎萊茵衣藻提取粗蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，有1條大約為58 kDa的蛋白條帶如中插彩版圖4，與理論結(jié)果相符合。

2.5 Western Blot檢測(cè)結(jié)果 以重組表達(dá)的G蛋白為抗原，鼠抗IHNV血清為首抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗鼠IgG為二抗，經(jīng)誘導(dǎo)后的G蛋白能與鼠抗IHNV血清反應(yīng)，在58 kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，如中插彩版圖5。以重組表達(dá)的目的蛋白為抗原，鼠源HIS標(biāo)簽抗體為首抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗鼠IgG為二抗，Western Blot結(jié)果顯示，目的蛋白能與鼠源HIS標(biāo)簽抗體反應(yīng)，在58 kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，與SDS-PAGE出現(xiàn)的目的蛋白一致如圖6。

圖6 Western Blot分析

2.6 病毒滴定測(cè)定結(jié)果 將病毒懸液做10倍倍比稀釋后接種到長(zhǎng)滿單層的FHM細(xì)胞的96孔板中，采用Karber 法計(jì)算出病毒懸液的TCID50為10-6.2/0.1 mL。

2.7 BALB/c小鼠增重效果 小鼠飼喂同樣的鼠糧和水，第1～7天每組每只小鼠每天灌胃，每日灌胃1次，一次200 μL,第1組灌喂轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，第2組灌喂萊茵衣藻，第3組、第4組灌喂PBS，第8天對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，第1、2、3組每只小鼠腹腔注射TCID50效價(jià)為10-6.2的IHNV 200 μL，第4組小鼠腹腔注射PBS 200 μL，第0、7、14、21、28天，每組隨機(jī)選取4只小鼠稱重，取平均值。第4組為對(duì)照組小鼠體重平穩(wěn)增長(zhǎng)，第3組小鼠灌喂PBS并腹腔注射IHNV，與第4組相比體重增長(zhǎng)緩慢，第1組和第2組第1～7天灌喂萊茵衣藻時(shí)體重較對(duì)照組增長(zhǎng)緩慢，將數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)可得，第1組29.6±0.063ab；第2組26.7±0.31b；第3組22.7±0.03a；第4組23.9±0.64a。由數(shù)據(jù)可知，腹腔注射IHNV后體重增長(zhǎng)明顯高于對(duì)照組，說明口服萊茵衣藻可增強(qiáng)免疫，促進(jìn)生長(zhǎng)，第1組和對(duì)照比，差異極顯著；第2組和對(duì)照組相比，差異顯著；而由圖7可知，第1組灌喂轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻小鼠體重增長(zhǎng)高于第2組，說明轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻對(duì)小鼠體重變化的影響更為顯著。

圖7 小鼠平均體重變化

第3組：PBS攻毒組，第4組：PBS組

2.8 小鼠脾臟細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定結(jié)果 將轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，萊茵衣藻，PBS分別給小鼠灌喂，連續(xù)灌喂7天，第8天對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，第14天每組隨機(jī)取4只小鼠，在無菌條件下取小鼠脾臟，并分離制備脾細(xì)胞懸液，用抗小鼠PE-CD3e、FITC-CD4、APC-CD8a單克隆抗體孵育后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定各組小鼠脾中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化情況見表1，淋巴細(xì)胞和CD3+T淋巴細(xì)胞設(shè)門方法如中插彩版圖8，結(jié)果如中插彩版圖9。試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌喂轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻組CD4+T淋巴細(xì)胞含量極顯著高于其他3組，CD8+T淋巴細(xì)胞含量與對(duì)照組相比也有所增加。轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻組和萊茵衣藻組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞含量都有所增加，都能夠刺激小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增值，并且小鼠無死亡現(xiàn)象，證明重組之后的蛋白不能對(duì)小鼠產(chǎn)生毒理效應(yīng)并且能夠刺激小鼠的免疫指標(biāo)升高。

表1 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組小鼠脾中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化情況 (x±s,%)

3 討論

萊茵衣藻是單細(xì)胞真核生物，隸屬于綠藻門，團(tuán)藻目，衣藻屬，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，可作為魚類的天然餌料[10-12]。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組萊茵衣藻通過IHNV病毒的糖蛋白基因插入到pChlamy-4載體上構(gòu)成pCh-IHNV-G重組質(zhì)粒，經(jīng)大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞的擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，將pCh-IHNV-G重組質(zhì)粒線性化，用電穿孔技術(shù)將其導(dǎo)入細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻中，線性化pCh-IHNV-G與萊茵衣藻基因組隨機(jī)重組，利用抗性篩選出轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。Western Blot的分析結(jié)果表明，糖蛋白在萊茵衣藻中得到了表達(dá)，具有反應(yīng)原性，本研究將轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻喂給小鼠，連續(xù)灌喂7 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻可刺激小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的增值，從而有助于提高機(jī)體的免疫應(yīng)答，證明了轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻具有一定的抗原性。

萊茵衣藻與螺旋藻相似可提高機(jī)體的免疫力，所以相應(yīng)的灌喂萊茵衣藻的小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量也有所增加。但是轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻對(duì)提高機(jī)體的免疫應(yīng)答方面更具有優(yōu)勢(shì)，其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在外源蛋白的表達(dá)上面。樊振川等[13]闡述了萊茵衣藻作為綠色細(xì)胞工廠生產(chǎn)重組蛋白的研究，表明利用萊茵衣藻葉綠體基因組和核基因組已成功表達(dá)了多種重組蛋白,如蛋白亞基疫苗、單鏈抗體、蛋白細(xì)胞因子、蛋白類激素和工業(yè)養(yǎng)殖業(yè)用酶等,初步證實(shí)了萊茵衣藻作為綠色細(xì)胞工廠方面的實(shí)用性。Beltran-Lopez 等[14]在萊茵衣藻葉綠體基因組中成功表達(dá)了口服嵌合蛋白 CTB p210。Dauvillée 等[15]成功地融合了AMA1 和 MSP1兩種臨床相關(guān)的瘧疾抗原，并將其結(jié)合到宿主細(xì)胞中的淀粉基質(zhì)蛋白-淀粉合酶顆粒上。轉(zhuǎn)化進(jìn)入萊茵衣藻核基因組中，隨后在葉綠體中進(jìn)行淀粉顆粒轉(zhuǎn)化。小鼠通過口服和腹腔注射兩種方法用轉(zhuǎn)基因淀粉顆粒進(jìn)行免疫，兩組均顯示瘧原蟲顯著減少，小鼠壽命有所增加。Sun等[16]將口蹄疫病毒抗原VPl與霍亂毒素B亞基(CTB)融合，重組到衣藻葉綠體表達(dá)載體中并且成功表達(dá)，融合蛋白CTBVP1顯示出一定的生物活性，證明了萊茵衣藻可以用來生產(chǎn)口服疫苗，并產(chǎn)生黏膜免疫。針對(duì)IHNV造成幼魚死亡率極高，而且魚類的主要免疫途徑為黏膜免疫，我們將IHNV的主要抗原糖蛋白在萊茵衣藻中得到了表達(dá)，為進(jìn)一步研制口服IHNV疫苗奠定基礎(chǔ)。

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