國(guó)翔

1.中國(guó)人民解放軍第九五醫(yī)院，福建 莆田 351100；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350102

電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響

陳順1聶焱2陳國(guó)翔3李寧3鄭雪峰3

1.中國(guó)人民解放軍第九五醫(yī)院，福建 莆田 351100；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350102

目的研究電針對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響。方法將SD雄性大鼠40只，SPF級(jí)，隨機(jī)分為兩組：造模組(30只)以及假手術(shù)組(10只)。采用線栓阻塞腦中動(dòng)脈法建立腦缺血再灌注損傷模型，腦缺血再灌注損傷后，造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組，每組15只。實(shí)驗(yàn)采用改良神經(jīng)評(píng)分法(mNSS)來評(píng)價(jià)大鼠的神經(jīng)功能，使用電針干預(yù)七天后，分別采用Western Blot和Real-time PCR法檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。結(jié)果電針干預(yù)7 d后，與模型組相比，在第5、7天電針組可顯著提高大鼠神經(jīng)行為功能(P<0.05，P<0.01)。電針干預(yù)7 d后，與模型組相比，電針組Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Caspase-3、Bax表達(dá)下調(diào)。結(jié)論電針可提高Bcl-2的表達(dá)、降低Caspase-3、Bax的表達(dá)，從而抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡。

腦卒中；腦缺血再灌注；電針；細(xì)胞凋亡

社會(huì)和生活方式的變化以及人口老齡化，中風(fēng)的發(fā)病率不繼升高，成為人類死亡的第二大病因，也是導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾的主要原因[1]。中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組調(diào)查資料表明，我國(guó)每年增加150萬至200萬的腦卒中患者，發(fā)病率約為1.5%，在我國(guó)目前有700余萬的腦卒中患者存活下來，但有450萬的腦卒中患者不同程度地喪失其勞動(dòng)能力和生活自理能力，致殘率可高達(dá)75%[2]。中醫(yī)藥治療腦卒療效肯定，而且有相關(guān)研究分析了針灸治療腦卒中的機(jī)制[3-5]。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，取“百會(huì)”穴，觀察電針對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血區(qū)腦組織中細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器材料 G6805-1A型電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器廠)； SPF級(jí)SD大鼠40只(福建中醫(yī)藥大學(xué))；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán))；毫針(貴州安迪醫(yī)療器械有限公司)；線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)；Bax抗體和Bcl-2抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；β-actin抗體(Cell Signalling公司)；Casepase 3抗體(生工生物工程(上海)公司)；RevertAid TM First strand cDNA Synthsis Kit(Fermenta公司)；Power SYBR? Green PCR Master Mix(life sciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注損傷大鼠模型的構(gòu)建 SD雄性大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始造模，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。根據(jù)參考文獻(xiàn)及前期經(jīng)驗(yàn)[6-8]實(shí)行左側(cè)MCAO手術(shù)。即將線栓插入勁內(nèi)動(dòng)脈直至顱內(nèi)大腦前動(dòng)脈的近端，有阻力出現(xiàn)時(shí)即停止插線(深度約18～20 mm)，結(jié)扎ICA的插線處以阻斷血流，造成腦缺血。2 h后將線栓稍稍向外拔出，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作同模型組，自由攝食飲水。

1.2.2 動(dòng)物分組及干預(yù)

1.2.2.1 動(dòng)物的分組 把造模之后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在1～3分范圍內(nèi)的大鼠作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，并將其隨機(jī)分成兩組：模型組(15只)、電針組(15只)。

1.2.2.2 動(dòng)物干預(yù) 電針組大鼠給予電針治療，具體治療方法如下：依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物圖譜》，選擇大鼠的百會(huì)穴(即雙耳前緣連線的中點(diǎn))，采用直徑為0.25 mm，長(zhǎng)為25 mm 的毫針，進(jìn)針角度為45°，進(jìn)針長(zhǎng)度為2 mm。之后連接電針儀，另一極連接大鼠耳尖，使用疏密波，其頻率為2/15 Hz， 強(qiáng)度為1 mA，每天1次，每次干預(yù)30 min，共7 d。假手術(shù)組、模型組不給予任何治療措施。

1.2.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)分方法 實(shí)驗(yàn)使用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分法(mNSS)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)價(jià)[9]，評(píng)分內(nèi)容包括平衡木實(shí)驗(yàn)、行走測(cè)試、反常運(yùn)動(dòng)、感覺測(cè)試、反射缺失和提尾反射等。具體評(píng)分細(xì)則見表1。

表1 mNSS神經(jīng)行為評(píng)分法

1.2.4 動(dòng)物取材 電針干預(yù)結(jié)束后，按照300 mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后，迅速取出腦組織，于冰上迅速分離出缺血側(cè)皮層腦組織，分別裝入凍存管中，放入液氮中速凍2 h后，保存于-80℃。

1.2.5 Real-time PCR法檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 取大鼠腦組織100 mg，加入Trizol試劑1 mL 后勻漿，提取總 RNA。取1 μg的總RNA，然后采用反轉(zhuǎn)錄體系把mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后把各個(gè)樣品的cDNA作為模板，使用SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN)對(duì)目標(biāo)基因(Caspase-3、Bcl-2、Bax，目的基因引物序列見表2)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算模型組和電針組相對(duì)于假手術(shù)組的目的基因的表達(dá)量，最終結(jié)果用相對(duì)表達(dá)量倍數(shù)表示。

表2 引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá) 取大鼠腦組織100 mg，加入RIRP裂解液勻漿，提取其總蛋白。使用SDS-PAGE垂直板全濕法進(jìn)行電泳，蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離之后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液封閉兩個(gè)小時(shí)后，分別加入Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗(稀釋比例均為1∶1000)，4℃條件下孵育過夜，次日用TBST洗3次，每次10 min，然后加入1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的第二抗體，在室溫下孵育2h，再用TBST洗3遍。加入ECL顯色劑，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，然后分析目標(biāo)條帶出現(xiàn)的灰度值，把目標(biāo)蛋白和β-actin的灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)量，比較每組之間存在的差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電針對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 采用mNSS神經(jīng)功能缺損評(píng)分法對(duì)大鼠展開神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組動(dòng)物在造模之后，其神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，表明腦缺血再灌注造成神經(jīng)功能障礙的作用明顯；電針干預(yù)后，第1、3天電針組和模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但第5、7天電針組神經(jīng)評(píng)分顯著低于模型組(P<0.05)，提示電針可提高腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能。見表3。

表3 電針對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 (分，

注：與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與MCAO組相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 電針對(duì)大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低，Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)，且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。而電針干預(yù)后，Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)，Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05，P<0.01)。如圖1所示。

2.3 電針對(duì)大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。而電針干預(yù)后，Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)減少(P<0.05，P<0.01)。如圖2所示。

3 討論

在中醫(yī)學(xué)腦卒中屬于“中風(fēng)”、“類中”的范圍，是由于竅閉神匿，神不導(dǎo)氣所導(dǎo)致，在治療時(shí)應(yīng)該遵從“病變?cè)谀X，首取督脈”的治病理論。百會(huì)屬于督脈，它具有醒腦開竅、升陽舉陷、益氣補(bǔ)虛、平肝息風(fēng)的作用。用電針刺激百會(huì)穴能夠減緩腦缺血損傷，縮小腦梗死體積，控制細(xì)胞的凋亡，從而增進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[9-11]。

腦卒中的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)較為復(fù)雜的多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的最終結(jié)局。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡，受到多個(gè)基因的調(diào)控，與多種退行性疾病有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞過度凋亡時(shí)，神經(jīng)元缺失，導(dǎo)致神經(jīng)變性和神經(jīng)肌肉疾病。腦缺血早期，缺血嚴(yán)重的梗塞中心區(qū)以壞死為主要特征，而神經(jīng)細(xì)胞的凋亡主要位于缺血半暗帶。缺血半暗帶位于缺血區(qū)的周圍及某些易缺血的部位。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞能量供應(yīng)不足，興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等都可能參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注后，皮質(zhì)區(qū)Bax、Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)則降低[12]。壞死的神經(jīng)細(xì)胞很難恢復(fù)，但可以通過干預(yù)調(diào)節(jié)上游信號(hào)，減輕細(xì)胞凋亡，這是目前腦缺血治療的策略所在，也是臨床常用藥物作用的靶點(diǎn)。Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，缺血半暗帶區(qū)域主要是其介導(dǎo)的神經(jīng)凋亡。臨床上，可以觀察到腦卒中患者治療后腦內(nèi)的Caspase-3活性顯著降低[13]。

電針療法是指在刺入人體穴位的毫針上，用電針機(jī)通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法。研究表明電針刺激相應(yīng)穴位可有效降低各種外傷、缺血缺氧等損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Liu Z等[14]采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞誘發(fā)全腦缺血20 min，再灌注后檢測(cè)海馬谷氨酸受體亞基2(GluR2)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可改善神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低再灌注后Bax / Bcl-2比值，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用的效果。實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR法檢測(cè)了缺血腦組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)電針療法可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3、Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax的比值，表明電針可以起到抗凋亡的作用。同時(shí)，Western Blot 法檢測(cè)蛋白的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗凋亡的作用。

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實(shí)驗(yàn)研究

陳順(1985-)，男，漢族，住院醫(yī)師，研究方向?yàn)槟X卒中的中西醫(yī)康復(fù)研究。E-mail:qlffjtcm@sina.com

R-332

A

1007-8517(2017)23-0050-04

2017-11-14 編輯：程鵬飛)