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1.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004;2.貴州圣濟堂制藥有限公司，貴州 貴陽 551400

降壓片微生物限度檢查方法研究

滕鈺1薛詠蘭1羅曼1李琴2徐洪1鄒莉1王俊1*

1.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004;2.貴州圣濟堂制藥有限公司，貴州 貴陽 551400

目的對降壓片的微生物限度檢查方法進行研究。方法通過研究降壓片成分的抑菌特性，按《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107進行微生物限度檢查方法適用性試驗。結果利用聚山梨酯80的中和作用，采用增大稀釋液和培養(yǎng)基體積方法進行試驗，計數(shù)方法適用性試驗中，稀釋液對照組與菌液對照組菌落數(shù)比值、試驗組減去供試品對照組菌落數(shù)與菌液對照組菌落數(shù)比值均在0.5～2之間；控制菌檢查方法適用性試驗均能檢出陽性對照菌。結論能夠消除抑菌成分干擾且所添加中和劑對微生物生長無影響，重現(xiàn)性好，確保檢測結果的有效性和準確性。

降壓片；微生物限度檢查；抑菌成分；方法適用性試驗

降壓片為非藥典品種，主要由黃芩、檞寄生、決明子、山楂、臭梧桐葉、桑白皮和地龍等7味藥物組成，具有降壓功能[1]?！吨袊幍洹?015年版[2]規(guī)定供試品微生物限度檢查方法的適用性須經(jīng)確認，以確保采用方法能適合于該產品的微生物檢查。筆者針對降壓片的成分抑菌特性和微生物限度標準等因素，對其微生物限度檢查方法進行研究，并對其進行方法適用性試驗，確定此方法的有效性。

1 儀器與材料

1.1 樣品 降壓片(貴州圣濟堂制藥有限公司：批號20170101、20170102、20170103,規(guī)格：0.5g)。

1.2 試驗環(huán)境 在D級背景下的局部B級單向流空氣的藥品潔凈實驗室中進行，其中陽性菌操作在Ⅱ級生物安全柜中進行。

1.3 菌種 黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)[CMCC(B)26003]；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]；枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]；乙型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiB)[CMCC(B)50094]；色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]，上述菌種均來源于中國藥品生物制品檢定所，試驗用菌株均為第4代。

1.4 試劑 聚山梨酯80(成都市科龍化工試劑廠，批號：2014112601)。

1.5 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)(批號：17032950)、胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基(TSA)(批號：1703254)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)(批號：17031651)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)(批號：150916)麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：1703139)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：1604055)、腸道增菌液體培養(yǎng)基(批號：1609072)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：17061281)，均由北京陸橋技術股份有限公司提供；RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：3303081)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號：3105468)，均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。本實驗室培養(yǎng)基適用性檢查結果表明，上述批次培養(yǎng)基均符合2015年版《中國藥典》要求。

1.6 儀器 PL602-L電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、DK- 98-II電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)、康氏振蕩器(常州榮華儀器制造有限公司)、BF240恒溫培養(yǎng)箱(Binder)、BSC-1300ⅡA/B3生物安全柜(ESCO)、MJ-250-1霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

2 方法

2.1 菌液制備 按《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106[2]要求進行制備。

2.2 供試液制備 取供試品10 g，加TSB(含10 %聚山梨酯80)至100 mL，振搖混勻，作為1∶10供試液。取20 mL 1∶10供試液，加TSB(含10 %聚山梨酯80)至100 mL，即得1∶50供試液。

2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 需氧菌總數(shù)計數(shù) 采用平皿傾注法。①試驗組。取1∶50供試液5份，每份10 mL，分別加入0.1 mL不大于100 cfu/mL金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌液，混勻，取1 mL注入直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，每株菌平行制備2個平皿，傾注20 mL溫度為45 ℃左右的融化的TSA，迅速混勻，冷卻凝固后倒置，于34 ℃條件下培養(yǎng)3 d，計數(shù)。②菌液對照組。取TSB代替供試液，其它操作同“試驗組”。③供試品對照組。取1 mL 1∶50供試液注入直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，平行制備2個平皿，其它操作同“試驗組”。④中和劑對照組。取含10 %聚山梨酯80的TSB代替供試液，同“試驗組”操作。⑤陰性對照組。取TSB代替供試液，不加試驗菌，其它操作同“試驗組”。

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù) 采用平皿傾注法。①試驗組。取1∶10供試液2份，每份10 mL，分別加入0.1 mL不大于l00 cfu/mL白色念珠菌和黑曲霉菌液，混勻，取1 mL注入直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，每株菌平行制備2個平皿，傾注45 ℃左右的融化的SDA 20 mL，迅速混勻，冷卻凝固后倒置，于34 ℃條件下培養(yǎng)3 d，計數(shù)。②菌液對照組。取TSB代替供試液，其它操作同“試驗組”。③供試品對照組。取1 mL 1∶10供試液注入直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，平行制備2個平皿，其它操作同“試驗組”。④中和劑對照組。取含10 %聚山梨酯80的TSB代替供試液，同“試驗組”操作。⑤陰性對照組。取TSB代替供試液，不加試驗菌，其它操作同“試驗組”。

2.3.3 回收率計算 本試驗為了消除干擾物的抑菌活性，稀釋劑中加入了中和劑(聚山梨酯80)，為確認其對微生物無毒性，中和劑對照組與菌液對照組的菌落數(shù)比值應在0.5～2范圍內，方能確認試驗的有效性。計數(shù)方法適用性試驗回收率=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)，所得結果應在0.5～2范圍內。

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗

2.4.1 試驗組 ①大腸埃希菌。取1∶10供試液10 mL,接種至100 mL TSB，加入不大于l00 cfu·mL-1大腸埃希菌，混勻，34 ℃條件下培養(yǎng)18 h，取其培養(yǎng)物1 mL接種至麥康凱液體培養(yǎng)基，43 ℃培養(yǎng)24 h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線于麥康凱固體平板，34 ℃條件下培養(yǎng)18 h，觀察結果。②耐膽鹽革蘭陰性菌。取1∶10供試液，23 ℃預培養(yǎng)2 h，分別取1 mL預培養(yǎng)物接種至兩管20 mL腸道菌增菌液中，分別加入不大于100 cfu·mL-1大腸埃希菌、銅綠假單胞菌，混勻，34 ℃培養(yǎng)24 h，分別取上述培養(yǎng)物劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板，34 ℃培養(yǎng)18 h，觀察結果。③沙門菌。取10 g供試品至200 mL TSB，加入不大于100 cfu·mL-1沙門菌，混勻，34 ℃培養(yǎng)18 h，取0.1 mL上述培養(yǎng)物接種至10 mL RV 沙門菌增菌液體，34 ℃培養(yǎng)18 h，取上述培養(yǎng)物劃線于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板，34 ℃培養(yǎng)18 h，觀察結果。

2.4.2 供試品對照組 不加試驗菌，其它操作同“試驗組”相應控制菌檢查法。

2.4.3 中和劑對照組 取含10 %聚山梨酯80胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替供試液，同“試驗組”操作。

2.4.4 陰性對照組 取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替供試品，同“供試品對照組”操作。

3 結果

3.1 微生物計數(shù)方法適用性試驗 對3個批號降壓片的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗，可觀察出供試品對照組均無菌生長；中和劑對照組與菌液對照組菌落數(shù)比值均在0.90以上，說明加入聚山梨酯80并未對菌株的生長造成影響。試驗組減去供試品對照組菌落數(shù)與菌液組菌落數(shù)比值也均在0.80以上。表明可采用該供試液制備方法和計數(shù)法測定該品種的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)。見表1。

3.2 控制菌檢查方法適用性試驗 對3個批號降壓片的大腸埃希菌、耐膽鹽格蘭陰性菌、沙門菌控制菌檢查方法適用性試驗，可看出供試品對照組均無菌生長，中和劑對照組、試驗組均能檢出相應陽性菌。說明可采用該供試液制備方法和控制菌檢查法。見表2。

表1 計數(shù)方法適用性試驗結果 (n=3)

表2 控制菌檢查方法適用性試驗結果

注：“+”表示檢出相應陽性菌，“-”表示無菌生長。

4 討論

降壓片的藥物成分黃芩、地龍對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌等均有較強抑制作用[3-5]，故在試驗初期考慮采用加聚山梨酯80進行中和。試驗中發(fā)現(xiàn)，加入中和劑1∶10供試液進行方法適用性試驗時，金黃色葡萄球菌不生長。另有研究表明，降壓片成分中決明子、山楂對細菌的抑制能力較強[6-8]，而對霉菌抑制不明顯。因此針對需氧菌計數(shù)，本研究以增加稀釋液體積來進行方法適用性試驗，最終采用1∶50供試液時，五株菌回收率均能達到要求。在控制菌檢查中，由于樣品中多種成分對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌有抑菌作用，故將耐膽鹽革蘭陰性菌中培養(yǎng)基的體積增大為20 mL，方能檢出相應的陽性對照菌；在沙門菌檢查中，將TSB體積從100 mL增大為200 mL時，可檢出陽性對照菌，這可能與黃芩對傷寒沙門菌敏感[3]有關。

由于組方成份復雜、劑型和給藥途徑的多樣性，中成藥品中微生物難分離培養(yǎng)的情況相對較多。某些檢驗方法可能會因為不能有效檢識藥品中存在的有害微生物，從而出現(xiàn)達不到方法重現(xiàn)性要求的問題；可通過研究品種抑菌特性，采取合規(guī)技術手段并結合方法適用性試驗來解決上述問題。針對單位轄區(qū)內企業(yè)所生產藥品品種進行微生物限度檢查方法適用性研究，有助于提高制藥企業(yè)微生物安全的風險防控能力，有力保障轄區(qū)內民族藥業(yè)的發(fā)展優(yōu)勢。

[1]中華人民共和國藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑(第四冊)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：96.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部) [S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：136-140.

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[8]袁永成.山楂粗黃酮抗氧化能力及抑菌活性研究[J]. 農產品加工學刊，2012(2)：53-56.

StudyonMicrobialLimitTestMethodofJiangyaTablet

ObjectiveTo develop microbiological examination method of the Chinese Pharmacopoeia(Ch.p)2015 Edition for Jiangya tablet.MethodsAccording to the 4th general rules1105,1106 and 1107 of 2015 Edition,the method suitability test both of microbial counting and control bacterial examination in three batches of smples after studying the antibacterial properties of the Jiangya tablet.ResultsWith expanding liquid volume and polysorbate 80 being taken, the colony ratio between the control group and the microbial group was in the range of 0.5～2.And the colony ratio between the test group minus sample group and microbial group was between 0.5 and 2 in the counting suitability test of aerobic bacteria，which was also taken of mould and yeast. Meanwhile the control bacteria were detected in the test group.ConclusionThe bacteriostasis interference of Jiangya tablet was eliminated by the methods which had been described above and the methods were feasible and reproducible.

Jiangya Tablet; Microbial Limit Check; Bacteriostasis; Method Suitability Test

貴州省民族藥微生物檢測及安全防控技術應用研究,貴陽市科技計劃項目(筑科合同編號:20171001號)。

滕鈺(1987-)，女，漢族，碩士研究生，主管技師，研究方向為微生物檢驗。E-mail：434640096@qq.com

王俊(1974-)，男，本科，副主任技師，研究方向為藥品微生物檢驗。E-mail：362983170@qq.com

R285

A

1007-8517(2017)23-0047-03

TENG Yu1XUE Yonglan1LUO Man1LI Qin2XU Hong1ZOU Li1WANG Jun1*

1.Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004,China;2.Guizhou shengjitang Pharmaceutical Co.,Guiyang 551400,China

2017-10-26 編輯：穆麗華)