1．廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2．廣東省中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429；3.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院、廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 中山 528458

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選金番止瀉膠囊中多糖的提取工藝

陳建龍1梁麗萍1賴(lài)岳曉2田素英3*

1．廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2．廣東省中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429；3.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院、廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 中山 528458

目的研究金番止瀉膠囊中多糖的最佳提取工藝。方法以多糖含量為指標(biāo)，用紫外分光光度法測(cè)金番止瀉膠囊中多糖含量，以加水量、提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選其最佳提取工藝。結(jié)果金番止瀉膠囊中多糖的最佳提取工藝為A1B3C3D3，即8倍量水，提取3次，提取溫度70 ℃，每次2 h。結(jié)論優(yōu)選的金番止瀉膠囊中多糖的提取工藝條件穩(wěn)定，提取充分，方法簡(jiǎn)便可行。

金番止瀉膠囊；優(yōu)選工藝；紫外分光光度法；多糖

金番止瀉膠囊是中山市名老中醫(yī)的驗(yàn)方，由金櫻根、番石榴葉、茯苓等組成，功可清熱、補(bǔ)虛、止瀉，臨床治療腹瀉效果良好。其中的金櫻根、茯苓均含豐富的多糖[1]。多糖為人體必需四大抑制病毒對(duì)細(xì)胞的吸附物質(zhì)之一，具有抗變態(tài)反應(yīng)，抑制病毒對(duì)細(xì)胞的吸附，可提高機(jī)體免疫力[2]。筆者以多糖為指標(biāo)，以正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選金番止瀉膠囊中多糖的提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)臨床新藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV1102紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)有限公司)；AUW220D電子天平(日本島津)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：081133-201604，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；金櫻根(批號(hào): 20160823)、番石榴葉(批號(hào):20160712)購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司，茯苓(批號(hào):20160920，廣州康圣藥業(yè)有限公司)，藥材經(jīng)廣東藥科大學(xué)田素英副教授鑒定均為正品。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗多糖的含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 確定最大波長(zhǎng)，精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg，置50 mL容量瓶中，加適量重蒸水溶解，以蒸餾水定容，搖勻，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.202 mg/mL)。取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于10 mL容量瓶中，加5%苯酚1 mL，混勻，迅速加濃硫酸5 mL，搖勻，以蒸餾水稀釋至刻度，在室溫狀態(tài)下經(jīng)全波長(zhǎng)掃描確定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液最大吸收波長(zhǎng)為490.2 nm。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1、1.5、2、2.5、3 mL，各自置于10 mL容量瓶中，分別加入5%苯酚l mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸溶液，振搖5 min，定容至刻度，放置至室溫。以蒸餾水做空白，按紫外分光光度法(中國(guó)藥典2015版一部附錄ⅤA)[3]，在490.0 nm 處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程：y=9.1747x+0.0199，相關(guān)系數(shù)r=0.9992。線性關(guān)系考察結(jié)果表明：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.0000～0.0606mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 方法學(xué)考察 制備供試品溶液按前期研究所得最佳組方比例[4]稱(chēng)取藥材10 g，加水100 mL，浸泡30 min后煎煮，合并濾液，濃縮至20 mL。取濃縮液5 mL加無(wú)水乙醇至10 mL，攪拌，3000 r/min離心10 min后取沉淀用乙醇洗滌至無(wú)色，揮干乙醇后，沉淀加蒸餾水溶解并定容于100 mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中稀釋至刻度，按“2.1.1”項(xiàng)測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次，RSD為0.68%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液1 mL，按“2.1.1”方法分別于0、30、60、90、120、150、180 min測(cè)定吸收度，結(jié)果供試品溶液RSD為0.58%，表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取前期研究所得最佳比例組成各6份，按上述供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按“2.1.1”方法測(cè)定吸收度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，RSD為2.49%，本方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知葡萄糖含量的供試樣品6份，各約5 g，按上述“制備供試品溶液”法制備樣品溶液共6份。再分別按100%比例準(zhǔn)確加入上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL?；靹蚝蟀础?.1.1”法測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。多糖的加樣平均回收率為100.09%，平均RSD為0.96%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 提取工藝的優(yōu)選 根據(jù)單因素預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，選取加水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、提取溫度(D)作為考察因素，以多糖含量作為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，篩選最佳工藝條件，正交因素水平見(jiàn)表2，提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表4 多糖含量方差分析結(jié)果

從表3極差可以看出，各因素對(duì)多糖提取的影響依次為：C>B>D>A，說(shuō)明提取溫度和提取次數(shù)對(duì)提取率影響較大。表4結(jié)果顯示，因素A、D對(duì)多糖提取無(wú)顯著性影響(P>0.05)，因素B、C對(duì)提取多糖的影響較顯著性(P<0.05)。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)先的最佳提取工藝為A1B3C2D3，即以8倍量水，在60 ℃時(shí)每次提取2 h，提取3次。

2.3 最佳提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取最佳組方比例的藥材粗粉3份各10 g，按正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝A1B3C2D3，即按60 ℃溫度，加入8倍量蒸餾水，煎煮3次，每次2 h，合并濾液，濾液濃縮至約50 mL，得樣品提取液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)供試品吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，3次實(shí)驗(yàn)測(cè)定值基本平行，多糖含量(mg/mL)分別為17.809、17.831、17.838，平均為17.826 mg/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，說(shuō)明優(yōu)選的工藝條件具有可行性。

但考慮到正交實(shí)驗(yàn)中的提取時(shí)間對(duì)多糖提取量無(wú)顯著性影響，且提取1h和提取2h相比多糖提取量無(wú)明顯提高，因此優(yōu)選的工藝條件改為A1B3C2D1。并按此工藝進(jìn)行了3份藥材用量為10g的驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖含量(mg/mL)分別為17.816、17.793、17.845，平均為17.818。此工藝與正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝相比，提取多糖量并無(wú)明顯降低，且提取時(shí)間縮短。 故生產(chǎn)上可采用8 倍量水，60 ℃提取3 次，每次1 h的工藝。

3 討論

多糖的提取方法較多，但多數(shù)采取水煎法，因煎煮法的過(guò)程和設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單，且多糖易溶于熱水中[5]，故本次試驗(yàn)采用煎煮法進(jìn)行提取。

根據(jù)多糖的理化性質(zhì)可以選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑，考慮到工藝的成本、安全性和醫(yī)院設(shè)備等方面，故選擇用水作為提取溶劑、醇沉分離多糖的方法，韓燕全等[6]以95%乙醇沉淀效果最佳，沉淀較為完全，而本試驗(yàn)采用在樣品溶液中加無(wú)水乙醇的沉淀方法，使多糖沉淀更為充分。

試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中多糖的含量，是多糖含量測(cè)定最常用的方法，其原理是多糖在硫酸作用下水解成單糖分子，脫水生成糖醛類(lèi)化合物，再將其與苯酚縮合成有色物質(zhì)，反應(yīng)后為橙黃色溶液，可在400～490 nm處有特征吸收，多采用紫外分光光度法測(cè)定多糖含量[7-8]。因此本次實(shí)驗(yàn)在400～500 nm波長(zhǎng)范圍對(duì)無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最大吸收波長(zhǎng)為490.2 nm，供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)為489.8 nm，兩者最大吸收波長(zhǎng)接近，故選擇兩者平均值490.2 nm作為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在60 ℃時(shí)，加水量為8倍，提取時(shí)間為1 h/次，提取3次，多糖提取最充分。因此，此工藝可作為金番止瀉膠囊中多糖的最佳提取工藝。

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廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省課題項(xiàng)目 ( 20151126) ; 2014 年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目( 2014036) ;廣東藥科大學(xué)“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”醫(yī)藥化工省級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心資助項(xiàng)目。

陳建龍(1995-)，男，漢族，本科，研究方向?yàn)橹兴帒?yīng)用。E-mail:zsxqtsy@126.com

田素英(1968-)，女，漢族，副教授，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帒?yīng)用研究與教學(xué)。E-mail:578820484@qq.com

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1007-8517(2017)23-0039-03

2017-10-25 編輯：鄧佳麗)