貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

傷痛克酊微生物限度檢查方法建立

王俊

貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

目的建立傷痛克酊中國藥典2015版微生物限度檢查方法。方法采用《中國藥典》2015 年版四部“1105和1106”項下方法對傷痛克酊進行微生物限度檢查方法適用性試驗。結(jié)果取1∶10 供試液，采用薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)、平皿法(1 mL/皿)測定霉菌和酵母菌總數(shù)時，試驗組回收率比值均在《中國藥典》2015年版規(guī)定的0.5～2范圍之內(nèi)； 銅綠假單胞菌檢查用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基為100 mL時，金黃色葡萄球菌檢查采用薄膜過濾法，培養(yǎng)基用量為100 mL時，實驗組均能檢出試驗菌。結(jié)論傷痛克酊需氧菌總數(shù)測定采用薄膜過濾法、霉菌和酵母菌總數(shù)測定采用平皿法(1 mL/皿)，銅綠假單胞菌檢查用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基為100 mL，金黃色葡萄球菌檢查采用薄膜過濾法，培養(yǎng)基用量為100 mL的方法適用于此藥品的微生物限度檢查，能真實反應(yīng)其微生物污染情況，有效保證藥品質(zhì)量，降低微生物安全風(fēng)險。

傷痛克酊；《中國藥典》2015版；微生物限度檢查

傷痛克酊其處方由姜黃、馬蹄金和地柏枝組成，是一種外用酊劑。為了使微生物限度檢查結(jié)果能真實反映藥品受微生物污染狀況，建立適合該品種的微生物限度檢查方法，按照《中國藥典》[1]2015年版四部通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法的要求進行方法適用性試驗,建立了傷痛克酊的微生物限度檢查方法，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 儀器與材料

1.1 供試品 傷痛克酊(規(guī)格:20mL/瓶，批號：151101、151102、151103，貴州萬勝藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2 儀器 1300A2生物安全柜(Thermo)、GR85DA高壓蒸汽滅菌器(致微廈門儀器有限公司)、DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、BF240電熱恒溫培養(yǎng)箱(德國賓德)、MJ-250-1霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。上述所有培養(yǎng)基均按廠家提供的使用說明書進行配制，適用性檢查結(jié)果全部符合中國藥典2015年版要求[1]。

1.4 菌種 試驗使用的菌種均在中國藥品生物制品檢定所購買,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC( B) 26003]第3代，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC( B) 10104]第3代，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC( B) 63501]第3代，白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC( F) 98001]第3代，黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F) 98003]第3代，所用菌株傳代次數(shù)均符合《中國藥典》2015年版四部規(guī)定的要求[1]。

2 方法

2.1 菌液制備 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部要求，將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種到胰酪大豆胨瓊脂平板上，32.5 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種到沙氏葡萄糖瓊脂平板上，22.5 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取上面的培養(yǎng)物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液配制成所需要濃度的菌懸液。將黑曲霉的培養(yǎng)物接種到沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，22.5 ℃培養(yǎng)7 d，加人聚山梨醋80含量為0.05% (mL/mL)的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將黑曲霉孢子洗脫形成孢子懸液。使用無菌一次性塑料滴管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，再使用聚山梨醋80含量為0.05% (mL/mL)的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液配制成試驗所需濃度的孢子懸液[1-2]。

2.2 微生物計數(shù)法適用性試驗

2.2.1 供試液制備 按藥典規(guī)定取兩個以上最小包裝的傷痛克酊10 mL，加入恒溫到45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖均勻即得1∶10供試液；取上述1∶10供試液10 mL加入恒溫到45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至20 mL，振搖均勻即得1∶20供試液；取1∶20供試液10 mL加入恒溫到45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至20 mL，振搖均勻即得1∶40供試液；取1∶10供試液10 mL加入恒溫到45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至60 mL，振搖均勻即得1∶60供試液；取1∶10供試液10 mL加入恒溫到45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖均勻即得1∶100供試液。

2.2.2 微生物計數(shù)法適用性預(yù)實驗 選用批號151101的傷痛克酊作為預(yù)實驗供試品。

2.2.2.1 試驗組 取2.2.1制備好的1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶100供試液，加入不大于供試液體積1%的試驗菌液(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，充分振搖均勻，最終使每1 mL供試液中所含菌量不大于100 cfu。分別取1 mL注入無菌平皿中，立即傾注溫度保持在46 ℃左右的胰酪大豆胨瓊脂(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉)和沙氏葡萄糖瓊脂(白色念珠菌和黑曲霉)，每一株試驗菌同時制備2個平皿，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，胰酪大豆胨瓊脂放置32.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，沙氏葡萄糖瓊脂放置22.5 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測定其平皿上生長的菌數(shù)。

2.2.2.2 供試品對照組 取2.2.1制備好的供試液，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換菌液，操作方法和試驗組相同。

2.2.2.3 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換供試液，操作方法和試驗組相同。

2.2.3 微生物計數(shù)法適用性正式實驗

2.2.3.1 試驗組 取傷痛克酊151101、151102、151103 3個批號1∶10供試液，加入不大于供試液體積1%的試驗菌液(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉)，充分振搖混勻，各吸取1 mL進行薄膜過濾，按無菌操作要求取濾膜，濾膜面朝上平貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)皿上，每一株試驗菌同時制備2個平皿，放置32.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定其平皿上生長的菌數(shù)；分別取含白色念珠菌、黑曲霉的供試液1 mL注入平皿中，每株試驗菌同時制備2個平皿，立即傾注冷卻至46 ℃左右的沙氏葡萄糖瓊脂，放置22.5 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測定其平皿上生長的菌數(shù)。

2.2.3.2 供試品對照組 取151101、151102、151103 3個批號的傷痛克酊供試液，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換菌液，操作方法和試驗組相同。

2.2.3.3 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換供試液，操作方法和試驗組相同。

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗

2.3.1 控制菌檢查方法預(yù)實驗

2.3.1.1 供試液的制備 制備方法同“2.2.1”。

2.3.1.2 金黃色葡萄球菌檢查預(yù)試驗 選用批號為151101的傷痛克酊1∶10供試液10 mL，分別接種至100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入“2.1”中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液(總量小于100cfu)，放置32.5℃恒溫培養(yǎng)18 h；挑取上面的培養(yǎng)物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置32.5 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。取3份1∶10供試液10 mL薄膜過濾(濾膜用耐乙醇材質(zhì))，一份用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗1次，每次100 mL/膜，1份用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗2次，每次100 mL/膜，另外1份用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL/膜，取出濾膜，放置于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，加入“2.1”中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液(總量小于100cfu)，放置32.5 ℃恒溫培養(yǎng)18 h；挑取上面的培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置32.5 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

2.3.1.3 銅綠假單胞菌檢查預(yù)試驗 選用批號為151101的傷痛克酊1∶10供試液10 mL，分別接種至100 mL、200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，再加入“2.1”中制備的銅綠假單胞菌菌懸液(總量小于100 cfu)，放置32.5 ℃培養(yǎng)18 h；挑取上面的培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置32.5 ℃培養(yǎng)24 h。

2.3.2 控制菌檢查方法正式實驗

2.3.2.1 供試液的制備 制備方法同“2.2.1”。

2.3.2.2 金黃色葡萄球菌檢查正式試驗 分別取批號為151101、151102、151103的傷痛克酊1∶10供試液10 mL，薄膜過濾(濾膜用耐乙醇材質(zhì))，用pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗2次，每次100 mL/膜，取出濾膜置于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，加入“2.1”中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液(總量小于100 cfu)，放置32.5 ℃培養(yǎng)18 h；挑取上面的培養(yǎng)物劃線接種到甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置32.5 ℃培養(yǎng)24 h。

2.3.2.3 銅綠假單胞菌檢查正式試驗 分別取批號為151101、151102、151103的傷痛克酊1∶10供試液10 mL，分別接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，再加入“2.1”中制備的銅綠假單胞菌菌懸液(總量小于100cfu)，放置32.5 ℃培養(yǎng)18 h；挑取上面的培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置32.5 ℃培養(yǎng)24 h。

3 結(jié)果

3.1 計數(shù)方法適用性試驗 按照這個方法計算回收率比值：試驗組菌回收率比值=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液對照組菌落數(shù)。

試驗結(jié)果見表1-1、表1-2、表1-3、表1-4、表2-1、表2-2，由試驗結(jié)果看，傷痛克酊對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，采用薄膜過濾法可消除其抑菌作用，故采用薄膜過濾法進行需氧菌總數(shù)檢查，霉菌采用平皿法(1mL/皿)進行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)時3個批號試驗組回收率比值均在《中國藥典》2015年版規(guī)定的0.5～2要求之內(nèi)，表明該方法的重現(xiàn)性較好，適用于傷痛克酊的微生物限度檢查中微生物計數(shù)法檢查，能有效保證該項目檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1-1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性回收試驗預(yù)試驗記錄

表1-2 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性回收試驗預(yù)試驗記錄

表1-3 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性回收試驗預(yù)試驗記錄

表1-4 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性回收試驗正式試驗記錄

表2-1 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性回收試驗預(yù)實驗記錄

表2-2 霉菌和酵母菌計數(shù)方法適用性回收試驗正式試驗記錄

3.2 控制菌檢查方法適用性試驗 通過預(yù)試驗，銅綠假單胞菌檢查培養(yǎng)基使用量為100 mL和200 mL時，試驗組均能完全檢出銅綠假單胞菌。金黃色葡萄球菌檢查培養(yǎng)基使用量為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mL時，試驗組均不能檢出金黃色葡萄球菌；采用薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗量為100 mL和200 mL時，試驗組均能檢出金黃色葡萄球菌。據(jù)此推論銅綠假單胞菌檢查培養(yǎng)基使用量為100 mL，金黃色葡萄球菌檢查采用薄膜過濾法，沖洗量為100 mL，培養(yǎng)基使用量為100 mL的方法可用于傷痛克酊控制菌檢查，按照這個方法對傷痛克酊3個批號供試品進行正式試驗，3個批號的試驗組均能正常檢出試驗菌。說明傷痛克酊用這個方法進行控制菌檢查時，方法可行，重現(xiàn)性好，可用于其微生物限度檢查中控制菌檢查，能真實反應(yīng)其微生物污染情況，有效保證藥品質(zhì)量，降低微生物安全風(fēng)險。

4 討論

微生物檢查作為藥品安全性的重要指標(biāo)，其標(biāo)準(zhǔn)的制定也隨著科技的發(fā)展、生產(chǎn)工藝水平的提高、國際貿(mào)易的日益增多及與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌的需求而逐步修訂提高[3]。具有抑菌性藥物的微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，主要取決于樣品本身在試驗條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖，檢驗時應(yīng)排除其抑制作用，使之不干擾染菌限度檢驗，結(jié)果方屬有效[4-5]。為了保證藥品質(zhì)量，應(yīng)該按照《中國藥典》2015版的相關(guān)要求建立適合傷痛克酊的微生物限度檢查方法，在方法學(xué)適用性試驗過程中，通過預(yù)實驗知道傷痛克酊對需氧菌有抑制作用、對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，故采用薄膜過濾法進行需氧菌計數(shù)檢查，使用1∶10供試液1 mL/皿進行霉菌和酵母菌計數(shù)檢查；而對金黃色葡萄球菌有抑制作用，故采用薄膜過濾法，沖洗量為100 mL，培養(yǎng)基使用量為100 mL的方法進行檢查；對銅綠假單胞菌沒有抑制作用，采用培養(yǎng)基使用量為100 mL的方法進行檢查。

微生物限度檢查可以正確地反映藥品企業(yè)生產(chǎn)工藝及處方比例的合理性及科學(xué)性，是保證和進行藥品衛(wèi)生質(zhì)量的重要手段和方法[6]。通過方法學(xué)適用性試驗得出的上述微生物限度檢查方法是有效的、可行的，可用于傷痛克酊的微生物限度檢查，檢測結(jié)果能正確反映產(chǎn)品被微生物污染的真實狀況，切實做到有效控制和提高藥品質(zhì)量，從而降低藥品由微生物污染帶來的安全風(fēng)險。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部)[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:140-149.

[2]中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所．中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：356-357．

[3]楊曉莉，李輝，馬英英，等.中國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法解讀[J]．藥物分析雜志，2016,36(6)：1102．

[4]杜爾再，鬧鬧爾再．牛黃解毒片微生物限度檢查方法的探討[J]．中國民族民間醫(yī)藥，2012,21(12)：46-47．

[5] 靳維.伏立康唑膠囊微生物限度檢查法及有效性驗證試驗研究[J].天津藥學(xué)，2010,22(4)：1-3．

[6] 馬緒榮，蘇德模．藥品微生物學(xué)檢驗手冊[M]．北京：科學(xué)出版社，2000：59．

EstablishmentofMicrobialLimitInspectionMethodofPainTincture

WANG Jun

Guizhou Province Food and Drug Inspection，Guiyang 550004,China

ObjectiveTo establish a method for microbial limit examination of Chinese Pharmacopoeia (2015 edition)about Pain tincture .MethodsMicrobial limit inspection method suitability test about Pain tincture was carried out according to “1105 and 1106”in four version of Chinese Pharmacopoeia( 2015 Edition).ResultsFrom 1 to 10 for the test solution，using the membrane filter method on the determination of the total number of aerobe，AGAR method (1 mL/dish) determination of the total number of mold and yeast，the recovery rate in the experimental group were range of 0.5 ～ 2 in the provisions of China Pharmacopoeia (2015 edition)；control bacteria were examined when Pseudomonas aeruginosa check with pancreatic dairy soy peptone liquid medium for 100 mL, Staphylococcus aureus, check the membrane filtration method is adopted and medium dosage were 100 mL.ConclusionDetermination of the total number of aerobe in Pain tincture using the membrane filter method，Determination of the total number of mold and yeast using the method of AGAR (1 mL/dish)；Pseudomonas aeruginosa check with pancreatic dairy soy peptone liquid medium for 100 mL，Staphylococcus aureus, check the membrane filtration method is adopted,Medium dosage for 100 mL method，the method Suitable for microbial limit examination of the drug, can reflect the microbial contamination condition, effectively guarantee the quality of drugs, reduce microbial safety risk.

Pain tincture ；Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition)；Microbiological examination

王俊(1974-)，男，本科，副主任技師，研究方向為食品、藥品、化妝品等微生物檢測。E-mail:362983170@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2017)23-0034-05

2017-10-22 編輯：鄧佳麗)