*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210046；2.河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471023

水生藥用植物黑三棱對(duì)多環(huán)芳烴的吸收、分布和代謝研究

戴仕林1王新勝2吳啟南1*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210046；2.河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471023

目的分析黑三棱對(duì)菲和芘的吸收、分布、代謝，為進(jìn)一步研究多環(huán)芳烴對(duì)三棱藥材品質(zhì)的影響提供依據(jù)。方法采用GC-MS對(duì)黑三棱植物的根、莖、葉以及沉積物中的菲、芘進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果200 mg/kg條件下，菲和芘在黑三棱植物根、莖、葉以及沉積物中的含量高于50 mg/kg生長(zhǎng)條件下各部分的含量；200 mg/kg生長(zhǎng)條件下，菲和芘在塊莖中的含量高于葉，50 mg/kg生長(zhǎng)條件下則相反；沉積物中含有菲和芘的降解中間產(chǎn)物鄰苯二酚。結(jié)論黑三棱對(duì)多環(huán)芳烴有較強(qiáng)的吸收、富集能力；菲和芘的濃度對(duì)黑三棱的生長(zhǎng)及在植物體內(nèi)的分布有著重要影響，其降解途徑與植物及其根際微生物的聯(lián)合作用有關(guān)。

黑三棱；多環(huán)芳烴；GC-MS；代謝

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，簡(jiǎn)稱PAHs)是指分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型化合物，包括菲(Phe)、芘(Pyr)、萘(Nap)等150余種化合物[1]。研究表明，多種PAHs具有致癌、致畸、致突變作用[2]，引起世界各國(guó)的重視。由于PAHs具有疏水性，沉積物中可檢測(cè)到多種PAHs[3-7]。植物生態(tài)修復(fù)具有不破壞生態(tài)環(huán)境的特點(diǎn)，受到越來越多研究者的關(guān)注[8-9]，吸收、富集或轉(zhuǎn)化有毒、有害物質(zhì)，從而達(dá)到修復(fù)的目的。另一方面，由于PAHs的生物富集性，通過食物鏈會(huì)影響到人類身體健康，研究表明，有機(jī)物污染物進(jìn)入植物體主要途徑是通過根部吸收和植物葉片吸收[10]，根系吸收主要通過共質(zhì)體傳輸和質(zhì)外體傳輸兩種主要途徑[11]；與陸生植物相比，多環(huán)芳烴在水生植物的吸收、富集、分布和代謝研究較少[12]。黑三棱科植物黑三棱(SparganiumstoloniferumBuch.-Ham)是典型的水生藥用植物，主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)[13]，歐洲和非洲等地也有分布，其塊莖為常用中藥，具有破血行氣，消積止痛的功效[14]。水生藥用植物是一類特殊環(huán)境下的中藥資源，水環(huán)境的改變對(duì)藥材品質(zhì)有很大影響[15]。筆者以黑三棱植物為研究對(duì)象，采用GC-MS分析其對(duì)菲和芘的吸收、分布和代謝狀況，為進(jìn)一步研究水環(huán)境改變對(duì)三棱藥材品質(zhì)影響提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GC-MS(Agilent GC6980/5973MSD)；12孔固相萃取裝置(美國(guó)Sigma公司)；BT125型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KH300SP型超聲儀(300 W；昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；EPED超純水系統(tǒng)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DCY-12S型氮吹儀(青島?？苾x器有限公司)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

1.2 試藥 菲(98%，批號(hào)：101081681)、芘(98%，批號(hào)：101024057)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；StrataPAH固相萃取小柱(美國(guó)Phenomenex公司)；甲醇(色譜純，批號(hào)：1799107539，德國(guó)Merck公司)；乙腈(色譜純，批號(hào)：JA040830，德國(guó)Merck公司)；超純水由實(shí)驗(yàn)室自制；其它化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 樣品來源及處理

1.3.1 污染沉積物的配制 將采自南京中醫(yī)藥大學(xué)藥苑，未被PAHs污染的粘土(有機(jī)質(zhì)0.3%，pH：6.09，速效N、P、K分別是10.63、1.00、56.00 mg/kg)，自然晾干，過2 mm篩，加入菲和芘的丙酮溶液，其中，高污染組(菲+芘，200 mg/kg)，低污染組(菲+芘，50 mg/kg)，以加入等體積丙酮的沉積物為對(duì)照[16]。

1.3.2 樣品采集和處理 黑三棱幼苗采自南京市浦口區(qū)石橋鎮(zhèn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒為黑三棱科植物黑三棱(SpargniumstoloniferumBuch-Ham)，選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的黑三棱植物幼苗，洗凈泥土，種植于不同污染程度的沉積物中。室外培養(yǎng)，及時(shí)加水，維持水深，實(shí)驗(yàn)過程中加入肥料以保證三棱生長(zhǎng)需求，連續(xù)培養(yǎng)5個(gè)月后，分別采集兩組的根、塊莖、葉以及沉積物，自然晾干，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量菲和芘，置于2 mL容量瓶中，乙腈定容，稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液，13000 rpm/min離心15 min后，備用。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取兩組的根、塊莖、葉以及沉積物樣品各5 g，分別置于具塞三角瓶中，分別加入正己烷-丙酮(1∶1)50 mL，超聲提取3次，提取液合并，3 ℃減壓回收溶劑至干，分別用乙腈-水(25∶75)50 mL洗滌殘?jiān)?，固相小柱萃取，分別用5 mL甲醇-水(1∶1)沖洗，抽干溶劑，再分別以6 mL二氯甲烷洗脫，氮?dú)獯蹈?，?.5 mL乙腈溶解，高速離心，備用。

2.3 色譜條件

2.3.1 菲和芘的色譜條件 GC條件：HP-5MS 30 m×0.250 mm毛細(xì)管色譜柱(Agilent公司)，載氣為高純He，進(jìn)樣口溫度240 ℃不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μL，初始溫度80 ℃以25 ℃/min升到140 ℃，然后以15 ℃/min，升到250 ℃，保留14 min。MSD條件：EI電離源70 eV，質(zhì)量范圍35～400 amu，離子源溫度230 ℃，選擇離子檢測(cè)(SIM)模式，菲和芘的定量離子分別為178和202。

2.3.2 菲和芘降解產(chǎn)物分析的色譜條件 GC條件：HP-5MS 30 m×0.250 mm毛細(xì)管色譜柱(Agilent公司)，載氣為高純He，進(jìn)樣口溫度240 ℃，頂空進(jìn)樣。初始溫度40 ℃，以5 ℃/min升到250 ℃，保持5 min，保留14 min。MSD條件：EI電離源70 eV，質(zhì)量范圍45～650 amu。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 取不同濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)y，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y=1.35×108x-197190，r=0.9999，線性范圍為0.215～215 μg/mL；芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1.75×108x-192435，r=0.9999，線性范圍為0.146～146 μg/mL。菲和芘線性關(guān)系良好。

2.5 結(jié)果

2.5.1 含量測(cè)定 按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，菲和芘的選擇離子掃描圖見圖1。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定菲和芘在黑三棱根、塊莖、葉以及沉積物中的含量，測(cè)定結(jié)果見表1。在高污染組，菲和芘在黑三棱根、塊莖、葉以及沉積物中的含量明顯高于低污染組。菲和芘在沉積物中的含量最高，其次是根；兩者在葉和塊莖中的含量，受污染程度高低影響而不同，高污染組中，塊莖中含量較高，低污染組中葉子中含量較高。

表1 不同樣品中菲和芘含量

組別PAHs沉積物根葉塊莖高污染組菲54294±8198 24643±3173 0593±00491002±0094芘101088±1812 54937±51310905±00421279±0114低污染組菲9062±42951837±01090331±00300171±0011芘30062±3302614217±11150400±00290260±0019對(duì)照組菲NDNDNDND芘NDNDNDND

2.5.2 沉積物的GC-MS分析 按照2.3.2項(xiàng)下菲和芘降解產(chǎn)物的色譜分析條件，對(duì)沉積物進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖譜如圖2所示，降解產(chǎn)物用面積歸一化法計(jì)算各個(gè)化學(xué)成分峰面積的相對(duì)百分含量，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照。結(jié)果見表2。

表2 菲和芘的降解產(chǎn)物

峰序號(hào)保留時(shí)間/min有機(jī)物相對(duì)百分含量/%119621，3-戊二烯05222058丙酸025322222-甲基丙醛167442380甲酸己酯021525023，4-二甲基-己酮111625713-甲基-呋喃055726262-甲基-3-丁烯-2-醇08082818乙酸01293112戊醛3573103659己酮0281143093-甲基-3-丁烯-1-醇0131243433-甲基-1-丁醇0161345552-甲基-2-丁烯醛009145075甲苯0171552332-甲基-2-丁烯-1-醇0151657391，3-二甲氧基-丙烷0031757806-甲氧基-2-己醇0251858282，3-丁二醇012196690糠醛0192067653-甲基-丁酸021217812山梨酸0202289892，5-二甲基-2，4-己二烯0342310426苯甲醛0342410747鄰苯二酚5002513019苯乙醛0226146543，7-二甲基-2，6-辛二烯-3-醇06927149141-甲基-3-環(huán)己烯-1-醇0152815276苯乙醇0052917596十二烷01130238092，3-二甲基-環(huán)己-1，3-二烯0653125868順-α-沒藥烯0203226696甲基β-萘酮39233270862，2-二甲基-1-苊酮012

2.6 結(jié)論 黑三棱對(duì)多環(huán)芳烴有較強(qiáng)的吸收、富集能力；菲和芘的濃度對(duì)黑三棱的生長(zhǎng)及在植物體內(nèi)的分布有著重要影響，其降解途徑與植物及其根際微生物的聯(lián)合作用有關(guān)。

3 討論

由菲和芘在黑三棱植物的根、塊莖、葉及沉積物中含量可知，黑三棱對(duì)菲和芘有較強(qiáng)的吸收、富集能力，且與沉積物受污染的程度呈正相關(guān)，污染程度越高，對(duì)菲和芘富集越多。

多環(huán)芳烴是通過植物根系的吸收、富集而轉(zhuǎn)運(yùn)到其它組織[17-19]，沉積物中菲和芘被黑三棱的根系吸收、富集后，轉(zhuǎn)運(yùn)到塊莖、葉子等組織，高濃度(200 mg/kg)菲和芘可能抑制了轉(zhuǎn)運(yùn)，使得塊莖中的含量高于葉；研究表明菲和芘在低濃度(50 mg/kg)時(shí)，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)[20]，轉(zhuǎn)運(yùn)加快，因此葉中的菲和芘含量高于塊莖。菲和芘分別為三環(huán)和四環(huán)類多環(huán)芳烴，由表1可知黑三棱對(duì)四環(huán)芘吸收、富集能力高于三環(huán)菲，但四環(huán)芘比三環(huán)菲在沉積物中殘留更持久，這與Sun等[21]和Chiapusio等[22]報(bào)道一致。

沉積物中多環(huán)芳烴的降解機(jī)制主要有植物直接吸收、植物釋放生物酶促進(jìn)降解以及植物與根際微生物的聯(lián)合作用降解[23]，其中微生物聯(lián)合降解多環(huán)芳烴的過程中會(huì)產(chǎn)生鄰苯二酚或取代鄰苯二酚的中間代謝產(chǎn)物[24]，然后進(jìn)一步裂解、開環(huán)進(jìn)入三羧酸循環(huán)。從降解產(chǎn)物分析結(jié)果中含有鄰苯二酚可知，實(shí)驗(yàn)中菲和芘的降解可能與植物及其根際微生物的聯(lián)合作用有關(guān)。

通過對(duì)菲和芘在黑三棱不同部位和沉積物中含量分布及降解產(chǎn)物分析，為進(jìn)一步研究和探討多環(huán)芳烴進(jìn)入黑三棱植物體內(nèi)的生物學(xué)過程及外源污染物對(duì)三棱藥材品質(zhì)的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Absorption,DistributionandMetabolismofPAHsinAquaticMedicinalPlants-SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.

DAI Shilin1WANG Xinsheng2WU Qinan1*

1.School of pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Centre of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210046, China;
2.School of Chemical Engineering and Pharmacy of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China

ObjectiveAnalysis the absorption, distribution and metabolism of PAHs inSparganiumstoloniferumBuch.-Ham. and provide a basis for the effect of PAHs on the quality of Sparganii Rhizoma.MethodsThe contents of Phe and Pyr in roots, stems, leaves ofSparganiumstoloniferumBuch.-Ham and sediments were determined by GC-MS.ResultsUnder the condition of 200 mg/kg, the contents of Phe and Pyr in roots, stems, leaves and sediments were higher than those under the condition of 50 mg/kg. The contents of Phe and Pyr in tuber were higher than that in leaves and the result was reversedunder the condition of 50 mg/kg.Thecatechol was found in degradation intermediates.ConclusionThe ability of absorption and enrichment ofPAHs ofSparganiumstoloniferumBuch.-Hamwas powerful. The growth ofSparganiumstoloniferumBuch.-Ham was affected by the concentration of Phe and Pyr. The degradation pathway was related to the combined effect of plant and rhizosphere microorganisms.

Sparganiumstoloniferum; PAHs; GC-MS; Metabolism

藥物研究

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(81073002);江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目。

戴仕林(1985-)，男，漢族，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail:leonard2511@126.com

吳啟南(1963-),男，漢族，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及品質(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail：qnwyjs@163.com

R284.1

A

1007-8517(2017)23-0021-05

2017-10-25 編輯：鄧佳麗)