賈本盼，袁曉金，范智義，胡 靜，李巨秀*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

面包皮中水溶性晚期糖基化終產(chǎn)物對人腎小管上皮細胞的氧化損傷

賈本盼，袁曉金，范智義，胡 靜，李巨秀*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是食品在熱加工和貯藏過程中形成的一類化合物，與心血管疾病、糖尿病、腎病等多種慢性病的發(fā)生有重要聯(lián)系。本實驗研究了含有AGEs的面包皮水提取物（bread crust extract，BCE）對人腎小管上皮細胞（human kidney tubular epithelial cells，HKCs）內(nèi)氧化應(yīng)激的影響及細胞損傷。采用不同質(zhì)量濃度的BCE處理HKCs，并經(jīng)噻唑藍法確定后續(xù)BCE處理質(zhì)量濃度；通過檢測細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）及培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平，評價BCE對HKCs胞內(nèi)氧化應(yīng)激平衡及細胞損傷程度的影響。結(jié)果表明：不同質(zhì)量濃度的BCE處理24 h后，HKCs胞內(nèi)ROS水平隨著BCE質(zhì)量濃度的增大不斷升高，且在8 mg/mL和12 mg/mL時胞內(nèi)ROS水平達到最大值；與對照組相比，胞內(nèi)MDA含量在BCE質(zhì)量濃度為4 mg/mL和8 mg/mL時極顯著增加（P＜0.01），但BCE質(zhì)量濃度達12 mg/mL時，MDA含量卻顯著降低（P＜0.05）。相反，胞內(nèi)總SOD活力卻隨著BCE質(zhì)量濃度的增大而降低，在8 mg/mL和12 mg/mL時，胞內(nèi)總SOD活力發(fā)生極顯著降低（P＜0.01）。胞外分泌型LDH水平隨著BCE處理質(zhì)量濃度的增大而升高，在BCE質(zhì)量濃度為8 mg/mL和12 mg/mL時，LDH活力發(fā)生極顯著增加（P＜0.01）。因此，BCE可以通過提高HKCs胞內(nèi)活性氧水平，引起胞內(nèi)總SOD活力降低，進而促進細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變細胞膜通透性，使胞外LDH活力升高，導致細胞嚴重受損。

人腎小管上皮細胞；面包皮水提取物；氧化損傷；脂質(zhì)過氧化

非酶糖基化反應(yīng)是還原糖如葡萄糖、果糖等與蛋白質(zhì)游離氨基之間發(fā)生的可逆反應(yīng)[1]，生成的Schiff堿經(jīng)過分子重排形成結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物。Amadori產(chǎn)物再經(jīng)過一系列化學反應(yīng)，包括多重脫水、裂解及活性二羰基中間產(chǎn)物的氧化修飾，形成多樣、穩(wěn)定的加合物，即晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）[2-3]。體內(nèi)AGEs的來源主要有體內(nèi)生成和膳食攝入兩種途徑，而長期攝入高AGEs含量的食物是引起體內(nèi)AGEs水平增加的主要原因[4]。

AGEs在體內(nèi)積累會引起機體產(chǎn)生一系列與氧化衰老或糖尿病相關(guān)的病理生理學疾病，如高血糖癥記憶力、肩凝癥、動脈粥樣硬化、慢性腎功能不全和阿爾茨海默綜合征等疾病[5-11]。AGEs與人體氧化應(yīng)激密切相關(guān)[12]，其主要通過與細胞表面特異性AGEs受體結(jié)合，引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改變，進而激活胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激反應(yīng)。

腎臟是AGEs在體內(nèi)循環(huán)與排泄的重要器官，腎功能損傷直接影響體內(nèi)AGEs水平及相關(guān)并發(fā)癥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎病的患病率逐年上升，全球發(fā)病率高達5%～7%[13]，其中西方國家成年人發(fā)病率為8%～10%[14]。在慢性腎病病人中，患高血糖或高血壓病人占3/4[15]。在許多腎臟疾病最終發(fā)展成為末期腎衰竭過程中，腎小管間質(zhì)受損程度與病情的發(fā)展趨勢有著密切聯(lián)系[16]。腎小管上皮細胞長期暴露于高濃度AGEs下可能會引起腎小管上皮細胞抗氧化性能損傷，加速腎臟疾病的產(chǎn)生。

AGEs可以改善食品色澤和風味，廣泛存在于面包等烘焙食品中。Ruhs等[3]通過對面包皮進行熱水浸提得到面包皮水提取物（bread crust extract，BCE），并通過斑點雜交實驗發(fā)現(xiàn)BCE中含有精氨酸-嘧啶、羧甲基賴氨酸、3-羥基-4-羥甲基-1-（5-氨基-5-羥基戊基）-吡啶和其他非特異性結(jié)構(gòu)的AGEs；進一步研究發(fā)現(xiàn)BCE可引起心肌成纖維細胞胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，核轉(zhuǎn)錄因子κB、p42/44和p38等信號通路激活及下游炎癥因子的表達。目前，對膳食AGEs與人類慢性病的關(guān)系研究較少，尤其在膳食中可溶性AGEs對人腎小管上皮細胞（human kidney tubular epithelial cells，HKCs）的損傷及降低HKCs抗氧化能力的研究還缺乏系統(tǒng)研究報道。

本研究通過B C E作用于H K C s，利用噻唑藍（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT）法分析BCE處理質(zhì)量濃度對HKCs活力的影響，通過檢測HKCs胞內(nèi)ROS水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及上清液中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活力的改變，進一步探究BCE對HKCs的損傷機理，為研究膳食性AGEs與人體健康之間的聯(lián)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HKCs購自國家實驗細胞資源共享平臺；面包購自楊凌當?shù)孛姘俊?/p>

DMEM/F12培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒 西安赫特生物科技有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；MDA試劑盒、總SOD試劑盒、LDH試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

3111型CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；YT-CJ-2N型超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心；XDS-1B倒置生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；Victor X3型多功能酶標儀 美國PE公司；PharmaSpec UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；CS110-4冷凍干燥機 丹麥LaboGene公司；RE201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予華儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 面包皮的提取

將面包皮經(jīng)室溫通風干燥后，粉碎機粉碎。BCE的提取方法參照文獻[17]并略作修改。準確稱取250 g面包皮粉末，加入300 mL氯仿，置于搖床中，室溫振蕩1 h，漏斗過濾棄濾液，重復操作3 次。剩余固體室溫通風干燥后，加400 mL蒸餾水，50 ℃水浴提取3 h，重復提取2 次。合并提取液，8 000 r/min、4 ℃離心20 min，0.45 μm濾膜過濾，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到固態(tài)BCE，密封存于-80 ℃待用。

1.3.2 面包皮及BCE中熒光性AGEs的測定

面包皮和BCE中熒光性AGEs的檢測參照Morales等[18]的方法，略加修改。稱取100 mg面包皮粉末于10 mL離心管中，加入1.2 mg/mL的鏈霉素蛋白酶E溶液3 mL（鏈霉素蛋白酶E溶于含5 mg/mL十二烷基硫酸鈉和1.47 mg/mL CaCl2的Tris-HCl中，pH 7.5）。漩渦振蕩后，于40 ℃搖床中振蕩消化36 h，冷卻后于4 ℃、4 500×g離心10 min。取上清液，0.45 μm濾膜過濾后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）適當稀釋后用熒光分光光度計在激發(fā)波長347 nm、發(fā)射波長415 nm處測定熒光強度，以AU/mg表示。

1.3.3 MTT法檢測BCE對HKCs活力的影響

37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HKCs，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM/F12。待細胞融合至80%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代，參照Mosmann[19]的方法進行MTT實驗。取對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液（約105個/mL），接種于96 孔板中，每孔200 μL，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，加無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入無血清培養(yǎng)基配制的4、8、12、16、20、25 mg/mL的BCE 200 μL，對照組以200 μL無血清培養(yǎng)基替代。每組設(shè)6 個復孔，培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2 次，每孔再加入150 μL MTT工作液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄孵育液，加150 μL DMSO，緩慢振蕩10 min，酶標儀于570 nm波長處測定OD值。以150 μL DMSO為空白組調(diào)零。細胞活力根據(jù)以下公式計算。

1.3.4 BCE對HKCs內(nèi)ROS水平的影響

根據(jù)Konrad等[20]的方法，對細胞內(nèi)ROS水平進行檢測。其中，細胞內(nèi)ROS水平與胞內(nèi)熒光強度成正比例關(guān)系。HKCs接種于12 孔板中，待細胞融合至90%左右，無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，用無血清培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的BCE（0、4、8、12 mg/mL）處理細胞24 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，加無血清培養(yǎng)基配制的10 μmol/L DCFH-DA熒光探針1 mL，37 ℃避光孵育20 min。棄探針培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)基洗滌，用熒光酶標儀于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長535 nm處檢測細胞內(nèi)熒光強度，表示胞內(nèi)ROS水平。

1.3.5 BCE對HKCs內(nèi)MDA含量及總SOD活力的影響

通過檢測MDA含量來評估細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和細胞膜受損程度，檢測總SOD活力來評估胞內(nèi)抗氧化酶系活力。細胞接種于6孔板中，按照1.3.3節(jié)方法處理細胞，待水提物處理24 h后，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗2 次，每孔加300 μL含有苯甲基磺酰氟（1 mmol/L）的RIPA裂解液，充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取裂解上清液（細胞蛋白提取過程均在冰上進行），采用試劑盒測定胞內(nèi)總蛋白含量、MDA含量和總SOD活力。

1.3.6 BCE對HKCs培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響

細胞培養(yǎng)和BCE處理均按照1.3.4節(jié)方法進行。待不同質(zhì)量濃度BCE處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液并用試劑盒測定LDH活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均進行3 次重復，數(shù)據(jù)以 ±s表示。利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進行分析，并通過Duncan’s新復極差法檢驗數(shù)據(jù)間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 面包皮和BCE中AGEs熒光強度

BCE組中AGEs熒光強度（2 072 AU/mg）與面包皮中AGEs總熒光強度（2 907 AU/mg）相比極顯著下降（P＜0.01）。但BCE組的熒光強度依然達到2 000 AU/mg以上，說明BCE中還含有較多熒光性物質(zhì)。

AGEs是多種分子結(jié)構(gòu)不同物質(zhì)的總稱，具有交聯(lián)及產(chǎn)生熒光的特性[21]。但羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸和吡咯素等AGEs無熒光性[22]，因此熒光性只能反映部分AGEs的含量[23]。Delgadoandrade等[24]對西方谷物早餐食品中熒光性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測，發(fā)現(xiàn)總熒光性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量是游離熒光性美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的10 倍左右。本實驗中，面包皮中總熒光性AGEs含量只達到BCE中的1.4 倍左右，經(jīng)水提取后主要為水溶性游離態(tài)AGEs。所以，高含量的AGEs可能是BCE引起細胞損傷的主要原因。

2.2 BCE對HKCs活力的影響

圖1 BCE對HKCs活力的影響Fig. 1 Effect of BCE on the viability of HKCs

如圖1所示，與對照組相比，BCE對HKCs活力的抑制在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。在BCE質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL時，HKCs活力雖有所抑制但均無顯著性差異（P＞0.05）。12 mg/mL BCE處理組對細胞活力的抑制與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。因此在不顯著影響細胞活力的前提下，選取4、8、12 mg/mL 3 個質(zhì)量濃度進行后續(xù)實驗。

Ruhs等[3]研究發(fā)現(xiàn)用BCE處理鼠心肌成纖維細胞時，30 mg/mL BCE并沒有對心肌成纖維細胞活力產(chǎn)生顯著性抑制，甚至在低質(zhì)量濃度下還提高了細胞活力。而本實驗中，BCE對HKCs活力產(chǎn)生了顯著的抑制作用，并隨著BCE質(zhì)量濃度的增大而增強。

2.3 BCE對HKCs胞內(nèi)ROS水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)ROS在細胞吞噬作用過程中對抵御抗原具有重要作用，但過量ROS能引起機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)，導致蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)及核酸的氧化，進而導致細胞死亡[25]。

圖2 BCE對上清液HKCs胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 2 Effect of BCE on ROS levels in HKCs

由圖2可知，與對照組相比，BCE處理后HKCs內(nèi)ROS水平隨著BCE質(zhì)量濃度的增加而升高。4 mg/mL BCE處理組時，胞內(nèi)熒光強度與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。而8、12 mg/mL BCE處理組細胞內(nèi)熒光強度與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），但兩處理組之間無顯著差異（P＞0.05）。

Tsukagoshi等[26]發(fā)現(xiàn)，高水平的ROS會損傷細胞，進而會導致細胞正常生理功能紊亂。本實驗中8 mg/mL BCE可能引起細胞內(nèi)抗氧化酶系活性受損，降低了對胞內(nèi)ROS的清除能力，導致胞內(nèi)ROS水平達到飽和狀態(tài)。因此，當BCE質(zhì)量濃度達12 mg/mL時，胞內(nèi)ROS水平不再發(fā)生顯著性增加（P＞0.05）。Mohd等[27]認為ROS作為糖化產(chǎn)物處理細胞后的中間產(chǎn)物，參與了細胞毒性作用，且這種毒性可能是由蛋白質(zhì)與細胞膜相互聚合或通過其他機制產(chǎn)生。

2.4 BCE對HKCs內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，被認為是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的標志物[7]。氧化應(yīng)激可誘導細胞膜脂質(zhì)體發(fā)生嚴重的過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，進而損傷細胞膜[28]。因此，可通過測定胞內(nèi)MDA含量變化來評價細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度[29]，進而間接地反映膜系統(tǒng)受損程度[30]。

圖3 BEC對HKCs胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 3 Effect of BCE on MDA content in HKCs

如圖3所示，BCE處理質(zhì)量濃度在0～8 mg/mL時，隨著BCE質(zhì)量濃度的增大，胞內(nèi)MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。8 mg/mL BCE處理組胞內(nèi)MDA含量約是對照組的2 倍，達到最大值。但12 mg/mL BCE處理組胞內(nèi)MDA含量與對照組相比卻顯著降低（P＜0.05），只達到對照組MDA含量的一半。

BCE處理HKCs后引起ROS水平升高，同時可能引起胞內(nèi)自由基含量也隨之增高，這些自由基可能通過誘導細胞膜脂質(zhì)過氧化，導致細胞損傷及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[31]。由此，BCE質(zhì)量濃度在0～8 mg/mL時，可能引起胞內(nèi)自由基含量增加，從而誘導細胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，使細胞膜受損。因此，胞內(nèi)MDA含量不斷升高意味著細胞膜的受損程度在不斷加劇。BCE質(zhì)量濃度達12 mg/mL時，胞內(nèi)MDA含量與對照組相比卻顯著降低（P＜0.05），表明12 mg/mL BCE可能嚴重損傷了細胞膜的正常功能，造成細胞膜通透性增加，導致胞內(nèi)MDA含量降低。

2.5 BCE對HKCs胞內(nèi)總SOD活力的影響

SOD作為重要的抗氧化酶系，在自由基引起的氧化損傷過程中，通過清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基，阻斷自由基連鎖反應(yīng)[32]，提高細胞抗氧化能力，保護細胞免受氧化損傷。機體內(nèi)SOD活力的下降表明機體抗自由基毒性能力下降，即機體氧化受損程度增加[33]。因此研究HKCs胞內(nèi)SOD活力可以評估BCE對胞內(nèi)抗氧化酶系的損傷程度，進一步確定BCE處理后細胞的受損程度。

圖4 BCE對HKCs胞內(nèi)總SOD活力的影響Fig. 4 Effect of BCE on total SOD activity in HKCs

如圖4所示，4 mg/mL BCE處理組細胞內(nèi)總SOD活力與對照組相比雖降低，但無顯著差異（P＞0.05），然而當BCE質(zhì)量濃度增加到8、12 mg/mL時，胞內(nèi)總SOD活力與對照組相比極顯著降低（P＜0.01），即隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，HKCs胞內(nèi)總SOD活力不斷降低。尤其當BCE質(zhì)量濃度為12 mg/mL時，胞內(nèi)總SOD活力與對照組相比降低了約45%。

SOD可防止超氧化物在細胞內(nèi)積累進而保護一些蛋白質(zhì)。細胞在新陳代謝過程中，胞內(nèi)SOD的缺乏會導致ROS在細胞內(nèi)大量積累，進而會損傷細胞內(nèi)一些大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA）及細胞膜[34-35]。因此，隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，引起HKCs胞內(nèi)ROS水平持續(xù)升高，胞內(nèi)高水平的ROS可能對胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞膜造成損傷，進而導致胞內(nèi)SOD活力持續(xù)降低，最終造成細胞損傷。

2.6 BCE對上清液中LDH活力的影響

LDH是一種胞內(nèi)酶，在糖酵解過程中可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸產(chǎn)生ATP，為細胞代謝提供能量。培養(yǎng)上清液中LDH活力增高意味著細胞膜受損或功能紊亂。因此，LDH可作為一個生物化學標記反應(yīng)疾病的嚴重程度的指標[36]。本實驗通過不同質(zhì)量濃度的BCE處理，檢測HKCs培養(yǎng)上清液中的LDH活力，即分泌型LDH活力，進而對BCE引起的HKCs細胞膜的損傷進行評估，作為判斷細胞受損程度的指標。

圖5 BCE對上清液中LDH水平的影響Fig. 5 Effect of BCE on LDH levels in culture supernatants of HKCs

由圖5可知，隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，上清液中LDH活力也隨之增加。4 mg/mL BCE處理組上清液中LDH活力與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。但當BCE質(zhì)量濃度為8、12 mg/mL時，上清液中LDH活力與對照組相比均極顯著升高（P＜0.01），且12 mg/mL BCE處理組上清液中LDH活力達到最大值。

細胞膜解體后將LDH釋放到細胞外，因此LDH可以作為組織損傷的非特異性標志物[37]。本實驗中，隨著BCE質(zhì)量濃度的增加，LDH活力不斷上升，意味著細胞受損程度加劇。在BCE質(zhì)量濃度達8、12 mg/mL時，HKCs細胞膜可能受損，導致細胞膜通透性增加，從而使上清液中LDH活力顯著增加。因此，BCE可能通過損傷細胞膜，增加細胞膜通透性，從而改變細胞正常生理功能，引起細胞受損。

3 結(jié) 論

本研究通過不同質(zhì)量濃度的BCE處理HKCs發(fā)現(xiàn)，BCE對HKCs活力具有顯著抑制作用。隨著BCE處理質(zhì)量濃度的增大，HKCs胞內(nèi)ROS水平不斷升高，進而引起細胞正常生理功能紊亂，導致胞內(nèi)總SOD活力不斷降低。BCE可誘發(fā)HKCs胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，使胞內(nèi)MDA含量升高，造成細胞膜受損、通透性增加，導致培養(yǎng)上清液中LDH水平持續(xù)升高，使細胞受損。因此，對AGEs引發(fā)抗氧化損傷的具體機制將進一步深入探究。

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Water-Soluble Advanced Glycation End Products from Bread Crust Cause Oxidative Damage to Human Kidney Tubular Epithelial Cells

JIA Benpan, YUAN Xiaojin, FAN Zhiyi, HU Jing, LI Juxiu*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Advanced glycation end products (AGEs) are a class of compounds that are formed during thermal processing and storage of foods, which are signif i cantly associated with various chronic diseases, such as cardiovascular diseases, diabetes,and kidney diseases. In the present study, bread crust extract (BCE), rich in AGEs, was obtained from bread crust through water extraction, and we investigated if BCE could cause intracellular oxidative stress and cell damage in human kidney tubular epithelial cells (HKCs). HKCs were treated with different BCE concentrations for determining the appropriate concentration of BCE by 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide assay for use in subsequent experiments. The effect of BCE on intracellular oxidative stress balance and the degree of cell damage was evaluated by detecting the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS), total superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde(MDA) and lactic dehydrogenase (LDH) in supernatants. The results indicated that the level of ROS in HKCs was increased along with increasing BCE concentration after being cultured with different concentrations of BCE for 24 h, and reached a maximum value at 8 and 12 mg/mL. Intracellular MDA contents increased signif i cantly at 4 and 8 mg/mL of BCE (P ＜ 0.01),but markedly declined at 12 mg/mL (P ＜ 0.05). On the contrary, intracellular SOD activity was reduced with increasing concentration of BCE, and signif i cantly decreased at BCE concentrations of 8 and 12 mg/mL. The level of secreted LDH was increased with increasing BCE concentrations, and the increase was highly signif i cant at 8 and 12 mg/mL (P ＜ 0.01).Therefore, BCE can cause serious damage to HKCs via elevating intracellular ROS levels, inhibiting total SOD activity and thereby promoting lipid peroxidation reaction, altering the cell membrane permeability, and consequently improving extracellular LDH activity.

human kidney tubular epithelial cells; bread crust extract; oxidative damage; lipid peroxidation

10.7506/spkx1002-6630-201801021

R151.3

A

1002-6630（2018）01-0136-06

賈本盼, 袁曉金, 范智義, 等. 面包皮中水溶性晚期糖基化終產(chǎn)物對人腎小管上皮細胞的氧化損傷[J]. 食品科學, 2018,39(1): 136-141.

10.7506/spkx1002-6630-201801021. http://www.spkx.net.cn

JIA Benpan, YUAN Xiaojin, FAN Zhiyi, et al. Water-soluble advanced glycation end products from bread crust cause oxidative damage to human kidney tubular epithelial cells[J]. Food Science, 2018, 39(1): 136-141. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801021. http://www.spkx.net.cn

2016-09-27

國家自然科學基金面上項目（31471579）

賈本盼（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)。E-mail：panjiaben@sina.com

*通信作者簡介：李巨秀（1972—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學與營養(yǎng)。E-mail：juxiuli@msn.com