劉楠楠 梁建琴 王金河 陳志 武麗紅 劉景陽(yáng)

·論著·

三種結(jié)核抗體試劑盒在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

劉楠楠 梁建琴 王金河 陳志 武麗紅 劉景陽(yáng)

結(jié)核； 病理學(xué),分子； 抗原抗體反應(yīng)； 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法； 診斷； 評(píng)價(jià)研究

結(jié)核病是全球感染性疾病中發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，是威脅全球和我國(guó)人群健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。結(jié)核病疫情嚴(yán)峻，但由于其臨床癥狀和體征不典型，診斷和鑒別診斷較困難，導(dǎo)致漏診率和誤診率較高，從而延誤最佳治療時(shí)機(jī)。因此，迫切需要快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法，指導(dǎo)臨床開(kāi)展早期有效的診治工作。

目前，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷手段主要包括細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等檢測(cè)方法，其中因血清免疫學(xué)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、快速實(shí)用、對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病具有輔助診斷價(jià)值而備受結(jié)核病領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注[2]。為進(jìn)一步了解目前臨床上常用的3種結(jié)核抗體試劑盒在診斷結(jié)核病中的應(yīng)用價(jià)值，本研究將3種結(jié)核抗體(TB-IgG、SD Rapid TB、TB-DOT)試劑盒檢測(cè)外周血結(jié)核抗體的結(jié)果與聚合酶鏈反應(yīng)反向斑點(diǎn)雜交法(polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB)行分枝桿菌菌種鑒定(以下簡(jiǎn)稱“分子病理”)的結(jié)果進(jìn)行比較，為臨床結(jié)核抗體檢測(cè)效能的評(píng)價(jià)提供參考。

資料和方法

1.研究對(duì)象：收集2015年1—12月解放軍第三〇九醫(yī)院病理科有組織標(biāo)本分子病理結(jié)果的601例患者資料，剔除重復(fù)、門(mén)診、院外會(huì)診患者89例，及分子病理為非結(jié)核分枝桿菌者7例[戈登分枝桿菌(MGO)6例，龜分枝桿菌(MCH)1例]、病理診斷不明確者149例和未行結(jié)核抗體檢測(cè)者151例，最終納入205例患者資料。205例患者中男127例、女78例，年齡12～87歲，中位年齡47歲。205例患者的病理標(biāo)本中，胸腹膜組織88例、骨關(guān)節(jié)脊柱組織54例、支氣管肺組織47例、腎輸尿管膀胱組織11例、胸腹壁軟組織2例、胃腸組織1例、附睪組織1例、輸卵管組織1例。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：3種結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒分別為T(mén)B-IgG[北京中檢安泰診斷科技有限公司，膠體金法，相對(duì)分子質(zhì)量38 000(38 kD)+相對(duì)分子質(zhì)量16 000(16 kD)]、SD Rapid TB(韓國(guó)SD 標(biāo)準(zhǔn)診斷公司，膠體金法，38 kD+其他混合抗原)、TB-DOT(上海奧普生物醫(yī)藥有限公司，膠體金法，38 kD)；分子病理試劑盒[亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司，分枝桿菌菌種鑒定]。

3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)血清結(jié)核抗體檢測(cè)：采集住院患者的晨起靜脈血4 ml于帶凝膠的紅帽血清管中，標(biāo)本按常規(guī)法分離、貯存。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按3種試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行，每份血清標(biāo)本均用3種試劑平行測(cè)定。(2) 組織分子病理檢查：組織標(biāo)本DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜、顯色等嚴(yán)格按照亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司分枝桿菌菌種鑒定檢測(cè)試劑盒要求執(zhí)行[3]。

4.結(jié)果判定：(1)分子病理診斷：試驗(yàn)?zāi)l上共有24個(gè)探針位點(diǎn)，臨床樣本與相對(duì)應(yīng)探針雜交位點(diǎn)顯色，表明被檢樣本檢測(cè)到相對(duì)應(yīng)的分枝桿菌DNA。該研究試驗(yàn)?zāi)l上結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)顯色為分子病理陽(yáng)性，不顯色為分子病理陰性[3]。(2)血清TB-IgG抗體檢測(cè)試劑盒結(jié)果判定：①陰性即只在質(zhì)控線C位置出現(xiàn)一條紅色條帶；②陽(yáng)性即質(zhì)控線C和檢測(cè)線T位置出現(xiàn)2條紅色條帶；③無(wú)效即質(zhì)控線C位置沒(méi)有出現(xiàn)紅色條帶。(3)SD Rapid TB抗體檢測(cè)試劑盒結(jié)果判定：①陰性即顯示窗內(nèi)僅出現(xiàn)一條紫色線；②陽(yáng)性即顯示窗內(nèi)出現(xiàn)2條彩色線(T線和C線)，或任一條線出現(xiàn)，均說(shuō)明結(jié)果陽(yáng)性；③無(wú)效即顯示窗內(nèi)未出現(xiàn)紫色線。(4)TB-DOT抗體檢測(cè)試劑盒結(jié)果判定：①陰性即質(zhì)控點(diǎn)顯示紅色，反應(yīng)孔中間無(wú)紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)或僅為痕跡；②陽(yáng)性即質(zhì)控點(diǎn)顯示紅色，反應(yīng)孔中間有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。上述結(jié)果中陽(yáng)性提示感染結(jié)核分枝桿菌，陰性表示未感染結(jié)核分枝桿菌。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用McNemar檢驗(yàn)對(duì)3種結(jié)核抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果與分子病理診斷結(jié)果進(jìn)行比較，有小于5的理論數(shù)，采用McNemar檢驗(yàn)的Continuity Correction(連續(xù)矯正)檢驗(yàn)，均以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kappa檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的一致性，將Kappa系數(shù)的大小劃分了6個(gè)區(qū)段，分別代表一致性的強(qiáng)弱程度：(1)Kappa值<0.00則為一致性強(qiáng)度極差；(2)Kappa值0.00～0.20則為一致性微弱；(3)Kappa值0.21～0.40則為一致性弱；(4)Kappa值0.41～0.60則為中度一致性；(5)Kappa值0.61～0.80則為高度一致性；(6)Kappa值0.81～1.00則為極強(qiáng)一致性。

結(jié) 果

1.分子病理檢測(cè)情況：205例患者中，傳統(tǒng)病理診斷為結(jié)核病(結(jié)核病組)且分子病理檢測(cè)陽(yáng)性者128例，均為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，分別為脊柱骨關(guān)節(jié)結(jié)核37例，腹盆腔結(jié)核(結(jié)核性腹膜炎、腸結(jié)核、輸卵管結(jié)核)35例，結(jié)核性胸膜炎31例，支氣管結(jié)核肺結(jié)核19例，腎結(jié)核4例，胸腹壁結(jié)核1例，附睪結(jié)核1例；傳統(tǒng)病理診斷明確為非結(jié)核病(非結(jié)核病組，不包括7例非結(jié)核分枝桿菌感染患者)且分子病理檢出陰性者77例，分別為胸腹膜間皮瘤15例，肺癌12例，肺炎9例，肺良性腫瘤7例，骨關(guān)節(jié)感染11例，脊柱布氏桿菌病6例，胃腸道腫瘤8例，泌尿系腫瘤7例，肝腫瘤1例，乳腺脂肪瘤1例。

2.結(jié)核抗體試劑盒的檢測(cè)效能：以分子病理檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)， TB-IgG、SD Rapid TB、TB-DOT等3種試劑盒的敏感度分別為26.6%(34/128)、20.3%(26/128)、97.7%(125/128)；特異度分別為90.9%(70/77)、98.7%(76/77)、3.9%(3/77)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為82.9%(34/41)、96.3%(26/27)、62.8%(125/199)；陰性預(yù)測(cè)值分別為42.7%(70/164)、42.7%(76/178)、50.0%(3/6)；正確指數(shù)分別為0.18、0.19、0.02，見(jiàn)表1。

3.試劑盒檢測(cè)結(jié)果的差異性和一致性比較：從表1看，TB-IgG和SD Rapid TB試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與分子病理結(jié)果比較，診斷差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；Kappa值均在0.00～0.20范圍內(nèi)，表明與分子病理結(jié)果均存在微弱的一致性。而TB-DOT試劑盒檢測(cè)結(jié)果與分子病理結(jié)果比較，診斷差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Kappa值=0.02，不能肯定與分子病理結(jié)果存在一致性。

討 論

我國(guó)現(xiàn)行的結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)仍是依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)、細(xì)菌病原學(xué)和免疫學(xué)等檢查結(jié)果。但WHO在2010年12月正式推薦使用Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)作為一種全新的結(jié)核病分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法，用于結(jié)核病及利福平耐藥的診斷。由于肺外結(jié)核的病原不易獲得，大多依靠影像學(xué)和治療效果進(jìn)行診斷，所以對(duì)MTB-DNA檢測(cè)(分子病理)在診斷肺外結(jié)核中的應(yīng)用越來(lái)越得到臨床醫(yī)生的認(rèn)可，對(duì)疑似結(jié)核病和肺外結(jié)核的診斷具有輔助作用。結(jié)核抗體檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷具有重要意義，尤其對(duì)涂陰、培陰、無(wú)痰、少痰及肺外結(jié)核是首選的檢測(cè)手段[4-5]。外周血結(jié)核抗體檢測(cè)具有快速、簡(jiǎn)便、敏感等優(yōu)勢(shì)[6]，其陽(yáng)性檢出率(80.0%)明顯高于痰涂片法(28.1%)[7]和培養(yǎng)法(48.7%)[8]，較痰涂片、培養(yǎng)法(周期2～8周)更具應(yīng)用價(jià)值，尤其在感染早期MTB菌量少或化療后細(xì)菌變異、死亡而難以培養(yǎng)時(shí)，其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)更明顯[9]。

結(jié)核抗體是機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌刺激后產(chǎn)生的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE等，其中IgG、IgM和IgA常用于臨床輔助診斷。在結(jié)核病發(fā)病過(guò)程中，最初是IgM升高，隨后IgG持續(xù)升高，并貫穿結(jié)核病始末，與高荷菌量相關(guān)聯(lián)[10]。喬帥[11]的研究表明，非活動(dòng)性肺結(jié)核的結(jié)核抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為53.85%，而活動(dòng)性肺結(jié)核的陽(yáng)性率則高達(dá)94.59%。38 kD、30 kD、27 kD、16 kD是從結(jié)核分枝桿菌中提取的蛋白，能與血清IgG、IgA、IgM特異性結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)抗原的檢測(cè)敏感度為57%～67%，當(dāng)與38 kD聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，在結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性者中其敏感度提高至91%，在結(jié)核分枝桿菌陰性者中提高至78%、特異度提高至97%[12]；Wu等[13]也有類(lèi)似的報(bào)道。由此可見(jiàn)，結(jié)核病的快速、準(zhǔn)確診斷有賴于多種抗原聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高敏感度和特異度，而38 kD在提高檢測(cè)敏感度和特異度方面效果顯著。

表1 3種結(jié)核抗體試劑盒的檢測(cè)效能比較

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%[a/(a+c)×100%]；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%[d/(b+d)×100%];陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%[a/(a+b)×100%];陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%[d/(c+d)×100%];正確指數(shù)(約登指數(shù))=(敏感度+特異度)-1；e：3種結(jié)核抗體試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與分子病理檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果；f:Kappa值的檢驗(yàn)值，因理論頻數(shù)小于5，為用McNemar檢驗(yàn)連續(xù)矯正(continuity correction)的檢驗(yàn)值

本研究中3種試劑盒均含有38 kD，其中，TB-DOT 試劑盒僅有38 kD單抗原，檢測(cè)敏感度高達(dá)97.7%，但特異度較低(3.9%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為62.8%，陰性預(yù)測(cè)值為50.0%，與以往報(bào)道(敏感度為50%～75%，特異度為91.64%)不一致[6,14]。另外，該試劑盒與分子病理比較，正確指數(shù)僅為0.02，Kappa值為0.02，P>0.05，不能肯定兩種方法存在一致性。由此可見(jiàn)，TB-DOT試劑盒雖檢測(cè)敏感度高，降低了漏診率，但特異度低導(dǎo)致誤診率大大增加，不能滿足臨床需求。故本研究結(jié)果提示，不推薦其作為臨床治療有效的檢測(cè)手段。原因一方面由于用于血清學(xué)檢測(cè)的抗原較多，不同的抗原自身特性不同，加之患者的不同病程階段對(duì)每種抗原的反應(yīng)也存在差異，必將影響相應(yīng)抗體檢測(cè)的敏感度和特異度。所以，試劑盒僅含有38 kD抗原，只檢測(cè)38 kD抗原無(wú)法檢測(cè)出患者血清中的其他抗結(jié)核抗體。另一方面可能與試劑盒的批次、質(zhì)量、結(jié)核分枝桿菌變異、質(zhì)量控制等有密切關(guān)系，影響了其在臨床上的應(yīng)用。TB-IgG和SD Rapid TB試劑盒為38 kD與其他抗原的混合；與TB-DOT相比，在特異度方面明顯提升(90.9%，98.7%)，但敏感度(26.6%、20.3%)均較低。但多數(shù)研究結(jié)果提示，TB-IgG的敏感度(78.08%)高于本研究結(jié)果(26.6%)[2]，可能由于試劑盒的質(zhì)量、批次、保存條件、操作員判讀、患者低免疫球蛋白水平和自身抗體等原因，出現(xiàn)一些假陰性。但本研究TB-IgG特異度為90.9%，更有助于結(jié)核病的確診。SD Rapid TB檢測(cè)的敏感度、特異度分別為20.3%、98.7%，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果(24.1%～39.2%)基本一致[15-16]。本研究中，TB-IgG試劑盒檢測(cè)結(jié)果與分子病理診斷結(jié)果比較，正確指數(shù)為0.18，Kappa值為0.14；而SD Rapid TB試劑盒的正確指數(shù)為0.19，Kappa值為0.15。由此可知，TB-IgG和SD Rapid TB試劑盒檢測(cè)結(jié)果均與分子病理診斷結(jié)果存在微弱的一致性，但SD Rapid TB的Kappa值和正確指數(shù)稍高，在3種檢測(cè)方法中相對(duì)較好。

本研究將3種結(jié)核抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果與分子病理結(jié)果進(jìn)行比較，在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究傳統(tǒng)病理診斷明確的205例行分子病理檢測(cè)的組織標(biāo)本中僅有47例來(lái)自于支氣管肺組織，其余158例均為肺外組織標(biāo)本，推測(cè)TB-IgG和SD Rapid TB 2個(gè)試劑盒檢測(cè)的敏感度較低，可能與分子病理檢測(cè)的是MTB DNA而不是活菌有關(guān)，也就是說(shuō)我院的手術(shù)標(biāo)本中有部分可能是陳舊性或穩(wěn)定性的肺外結(jié)核。下一步筆者將追蹤患者的其他指標(biāo)，如現(xiàn)病史、既往史、血紅細(xì)胞沉降率、病理抗酸染色和培養(yǎng)、治療效果和不同治療階段抗體水平等，綜合客觀地判斷結(jié)核抗體對(duì)肺結(jié)核、肺外結(jié)核的臨床輔助診斷價(jià)值。

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Evaluationofthreetuberculosisantibodykitsintuberculosisdiagnosis

LIUNan-nan,LIANGJian-qin,WANGJin-he,CHENZhi,WULi-hong,LIUJing-yang.

DepartmentofTuberculosis,theTuberculosisReserchInsititute,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

LIANGJian-qin,Email:ljqbj309@163.com

Tuberculosis； Pathology,molecular; Antigen-antibody reactions; Laboratory techniques and procedures; Diagnosis; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.010

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所結(jié)核二科

梁建琴，Email：ljqbj309@163.com

2017-09-27)

孟莉 薛愛(ài)華)