劉容枝

·專家筆談·

結核分枝桿菌抗體檢測試劑及相關問題的探討

劉容枝

結核分枝桿菌抗體檢測試劑在結核病輔助診斷中的作用已寫入相關指南。WHO對結核抗體檢測試劑在臨床的應用價值提出了質疑。作者分析了結核分枝桿菌抗體檢測試劑在中國的注冊現(xiàn)狀并剖析了可能的原因；同時，對結核抗體檢測試劑注冊申報中的主要原材料、分析性能，以及臨床試驗中的重點問題進行了闡述。

分枝桿菌，結核； 抗體； 試劑盒，診斷； 臨床試驗； 基于問題的學習

世界衛(wèi)生組織(WHO)2017年全球結核病報告顯示，結核病是全世界的第九大死因，在傳染性疾病中排名第一，超過艾滋??；中國結核病患者的例數(shù)位居世界第三，并且是世界三大耐多藥結核病高發(fā)國家之一[1]。這些數(shù)據(jù)顯示，我國結核病的防控壓力依然不容樂觀，正確診斷結核病(特別是菌陰結核病)已成為結核病防控工作中的重要環(huán)節(jié)。

結核病的診斷需要結合患者癥狀、體征、影像學檢查結果，以及其他多種輔助診斷方法進行綜合判斷。常見的實驗室診斷方法包括：(1)病原學檢測方法：如涂片、培養(yǎng)及核酸檢測等；(2)血清學檢測方法：抗原檢測、抗體檢測及γ干擾素檢測等[2]。

根據(jù)我國法律規(guī)定，結核抗體檢測試劑按照三類體外診斷試劑進行管理。截至目前，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準的國產結核抗體檢測試劑30個、抗原檢測試劑3個，進口結核抗體檢測試劑盒3個，檢測方法涉及膠體金法、酶聯(lián)免疫方法、化學發(fā)光法及蛋白芯片法；其中涉及膠體金法試劑約占70%，這主要與結核抗體檢測試劑在我國的臨床定位有關。我國結核病患者多分布在偏遠農村，基層醫(yī)療條件相對落后。而膠體金法操作簡單，對一線技術人員操作要求較低，比較適于基層使用。已上市的試劑盒中，檢測靶標大多為IgG抗體和總抗體，這與病毒類抗體檢測試劑存在明顯差異。病毒類抗體檢測試劑的檢測靶標包括IgM抗體、IgG抗體及總抗體等。究其原因，結核分枝桿菌是一種胞內感染菌，侵入人體后可長期潛伏，由感染至發(fā)病時間較長，而IgM抗體在結核分枝桿菌感染者體內存在時間較短。病毒感染人體后激發(fā)的主要是體液免疫反應，IgM抗體在急性反應期會顯著升高，因此，IgM抗體檢測對于病毒早期感染的輔助診斷有較大意義。

2011年，WHO發(fā)布了一項政策建議，指出目前商業(yè)化的結核病血液學檢測試劑常常導致結核病的誤診和不當治療[3]。因此，WHO敦促各國禁止使用不準確的和未經(jīng)批準的血液檢測方法。為加強該類試劑的管理，國家食品藥品監(jiān)督管理總局參考WHO的上述建議，于2012年發(fā)布了《關于進一步加強結核病血液檢測試劑監(jiān)管有關事宜的通知》，委托中國食品藥品檢定研究院組織開展我國結核病血液檢測試劑的抗原來源和質量控制標準等有關情況的調研[4]。自2014年起，基本沒有新的結核抗體檢測試劑進行注冊申報。筆者認為，該類試劑注冊申報減少的原因可能有以下幾點：第一，近幾年來，中國醫(yī)療器械注冊法規(guī)進行了較大修訂，國家加強了對醫(yī)療器械臨床試驗的監(jiān)管，對臨床試驗的科學性和規(guī)范性提出了更高要求，生產企業(yè)需要適應；第二，從臨床實際應用來看，病原學檢測與血清學檢測相比，對結核病的診斷可能具有更大價值。隨著結核分枝桿菌核酸檢測試劑被臨床普遍接受，臨床對血清學抗體檢測試劑的需求有所下降，生產企業(yè)根據(jù)市場風向調整了產品布局；第三，國家對結核病管理的重點在政策層面發(fā)生了較大變化，正在修訂的結核病臨床診療指南也有較大變化，這些都會影響生產企業(yè)的產品布局。

結核抗體檢測試劑采用常規(guī)的抗原抗體反應原理，是一種比較成熟的免疫學檢測方法。筆者回顧分析了技術審評中的一些個人體會，總結如下。

一、主要原材料研究

結核抗體檢測試劑最主要原材料為抗原?？乖募兌戎苯佑绊懏a品的檢測特異度；抗原的包被總量直接影響產品的檢測敏感度。其次，固相載體的負載容量及酶標二抗的活性均會影響產品的檢測敏感度和特異度。目前，該類試劑所用抗原基本為大腸埃希菌表達的重組抗原。該類抗原純度高，一般包括結核分枝桿菌引起特異性抗體反應的抗原片段，這就保證了在有限的固相表面包被盡可能多的有效抗原表位。但重組抗原也存在一定缺陷：重組抗原一般為原核表達，缺少真核表達具有的糖基化等修飾，可能會影響抗原的抗原性；另外，原核表達會引入宿主蛋白，可能導致非特異性交叉反應，而降低產品的檢測特異度。固相載體多為微孔，微孔面積有限，因此，近年來出現(xiàn)了蛋白芯片，可以擴大抗原的負載面積，增加檢測的敏感度；但蛋白芯片較為昂貴，結果判讀更為復雜，對試驗檢測人員的要求較高。

通常采用企業(yè)參考品來選擇合適抗原。企業(yè)參考品的制備一般采用至少2家已上市試劑盒篩選臨床血清或血漿，選擇幾種試劑同時檢測為陰性或陽性的臨床血清或血漿，獲得一系列不同滴度的結核抗體陽性和陰性血清或血漿，作為企業(yè)陽性參考品和陰性參考品。陽性參考品建議包括臨界陽性、中等陽性及強陽性樣本，以覆蓋臨床可能出現(xiàn)的各種濃度的樣本，便于選擇具有高敏感度的抗原；陰性參考品則建議包括可能產生交叉反應的、其他病原體陽性的臨床樣本，便于選出具有高特異性的抗原。因此，筆者建議申請人在該部分資料中，應詳細描述企業(yè)參考品制備和主要原材料選擇的詳細資料，包括試驗方法、數(shù)據(jù)和結論等。

二、分析性能評估

結核抗體檢測試劑為定性檢測試劑，應該包括定性檢測試劑的常見項目，如陰性符合率、陽性符合率、最低檢測限、精密度、特異度和干擾等試驗。陰性符合率一般采用陰性企業(yè)參考品來進行試驗，陽性符合率一般采用陽性參考品進行試驗。最低檢測限一般采用系列稀釋的血清或血漿樣本進行試驗，確定能檢出陽性的最高稀釋倍數(shù)。特異度重在驗證是否與臨床表現(xiàn)相似的其他疾病具有交叉反應性。干擾試驗一般對血液樣本中的常見干擾進行驗證。筆者建議申請人參考國內外相關技術文件，如由國家臨床實驗室標準委員會出版的相關評價方案等，科學合理設計實驗，進行驗證。

三、臨床試驗

臨床試驗基于3個基本原則：倫理原則、依法原則和科學原則[5]。具體而言，建議注意以下幾點。第一，倫理批件。臨床機構應出具蓋有臨床機構倫理委員會公章的正式的倫理批件，如臨床試驗機構確實沒有倫理委員會，應出具有關倫理的相關說明。新舊體外診斷試劑臨床試驗指導原則在倫理方面有較大的變化，企業(yè)在臨床試驗過程中應注意。第二，臨床試驗機構。體外診斷試劑臨床試驗機構應獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局的資質認可。在醫(yī)療器械臨床試驗機構目錄發(fā)布之前，該類試劑的臨床試驗應在省級以上衛(wèi)生醫(yī)療機構進行。建議該類試劑盡可能選擇醫(yī)院作為臨床試驗機構。建議企業(yè)密切關注藥監(jiān)局的相關法規(guī)，按照要求選擇臨床試驗機構。第三，臨床試驗人群。該類試劑的預期用途為結核病的輔助診斷。臨床試驗的入選人群應為其適用人群。根據(jù)其預期用途，臨床試驗的入選人群應為疑似結核病患者。臨床原始數(shù)據(jù)中，應明確每例患者的年齡、性別和臨床診斷等信息，以判斷入選人群是否合理。建議包括一定數(shù)量的肺結核和肺外結核患者，一定數(shù)量的涂片陰性和涂片陽性的結核病患者，包括一部分易與結核病混淆的其他疾病患者。

在注冊審評過程中，筆者發(fā)現(xiàn)該類試劑的臨床試驗存在如下問題：(1)臨床方案和報告前后不一致；(2)未嚴格按照對比試劑和申報產品的產品說明書進行試驗；(3)無故刪除試驗患者；(4)入選患者選擇偏倚，如選擇大量健康人群作為特異度驗證的適用人群，人為提高檢測特異度；(5)僅給出陰性符合率和陽性符合率等，未進行定性統(tǒng)計分析等。

綜上所述，結核病的診斷較為復雜，需要更多的好產品用于臨床輔助診斷，幫助臨床醫(yī)生做出正確的診斷。結核抗體檢測試劑在臨床上有其應用價值，但是也存在一定的缺陷。正確看待上述結核抗體檢測試劑盒的應用價值，努力提升其質量，是醫(yī)療機構、企業(yè)和監(jiān)管部門共同的責任。

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2017.Geneva: World Health Organization,2017.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.肺結核診斷標準(WS288-2008).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[3] World Health Organization.World Health Organization(2011)policy statement: commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis.Geneva: World Health Organization,2011.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.關于進一步加強結核病血液檢測試劑監(jiān)管有關事宜的通知[EB/OL].(2012-04-16)[2017-11-20].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0845/71147.html.

[5] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.國家食品藥品監(jiān)督管理總局關于發(fā)布體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則的通告[EB/OL].(2014-09-11)[2017-11-20].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/106241.html.

DiscussionontheproblemsrelatedtoMycobacteriumtuberculosisantibodydetectionreagents

LIURong-zhi.

CenterforMedicalDeviceEvaluation,ChinaFoodandDrugAdministration,Beijing100081,China

LIURong-zhi,Email:liurz@cmde.org.cn

The role ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents in the diagnosis of tuberculosis has been involved in the related guidelines.The application ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents in clinic has been questioned by the World Health Organization (WHO).This paper analyzes the current status of the registration ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents in China and the possible reasons.Meanwhile,we expound the key issues of main raw materials,performance analysis and clinical trial in the registration and declaration ofMycobacteriumtuberculosisantibody detection reagents.

Mycobacteriumtuberculosis; Antibodies; Reagent kits,diagnostic; Clinical trial; Problem-based learning

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.006

100081 北京，國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心

劉容枝，Email：liurz@cmde.org.cn

2017-11-21)

李敬文)