趙玲艷+張紅芳+陳崇蓮+陳曄

摘要： 為優(yōu)化枸骨總皂苷的提取工藝，研究枸骨總皂苷的抗氧化活性。用超聲-微波協(xié)同萃取法，以提取時間、提取功率、料液比為考察因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法（response surface methodology，簡稱RSM）Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計，優(yōu)化枸骨總皂苷的提取工藝；采用清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryylhydrazyl，簡稱DPPH）自由基能力分析枸骨總皂苷的抗氧化活性。結(jié)果表明，采用超聲-微波協(xié)同萃取法，在提取時間180 s、提取功率 100 W、料液比1 g ∶ 30 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%的條件下，枸骨總皂苷的提取率為 3.739 3%；抗氧化試驗結(jié)果表明，枸骨總皂苷濃度為62.24 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為 24.22%，表明響應(yīng)曲面法優(yōu)化了枸骨總皂苷的提取工藝，枸骨總皂苷具有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞： 枸骨總皂苷提取工藝；超聲-微波協(xié)同萃取法；響應(yīng)曲面法；抗氧化活性；DPPH自由基

中圖分類號： R284.2 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0205-05

枸骨（Ilex cornuta）為冬青科冬青屬常綠植物，主要分布于長江流域、秦嶺山脈的局部及以南各地，是苦丁茶的主要植物來源之一 。枸骨葉中含有多種對人體有益的成分包括氨基酸、維生素、苦味素、脂多糖和多種微量元素[3]。其根、枝、葉和果實均可入藥，具有清火解毒、止渴生津的功效，主要的活性成分是三萜皂苷：枸骨葉含有冬青苷Ⅰ甲酯（ilexosideⅠ methy lester）、冬青苷Ⅱ（ilexoside Ⅱ）、苦丁茶苷等皂苷類化合物[4-6]。皂苷廣泛存在于植物體內(nèi)，具有廣泛的生物活性和功能，如抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗生育、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、保肝活性等作用[3，6-7]。

超聲-微波協(xié)同萃取是近年來發(fā)展的一門新技術(shù)，用于枸骨總皂苷的提取，不但操作簡便、副產(chǎn)物少，而且能縮短提取時間、增加提取率，還能降低操作費用，符合環(huán)境保護的要求[8]。響應(yīng)曲面法（response surface methodology，簡稱RSM）可以采用二次回歸方程擬合多個因素與多個響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程分析尋求最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)曲面法具有周期短、回歸方程精度高、能研究多種因素間交互作用等優(yōu)點[8]。

關(guān)于枸骨葉皂苷提取的研究還很少[9-10]，本研究擬通過超聲-微波的提取方法和響應(yīng)曲面法確定枸骨葉中皂苷提取的最佳工藝條件，并對其抗氧化作用進行探討，為進一步開發(fā)利用枸骨葉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：2016年7月于江西省九江市南湖公園采集枸骨葉片，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

試劑：齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海如吉生物科技公司）；維生素C對照品（BTH，德國進口）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryylhydrazyl，簡稱DPPH，南京奧多福尼生物科技有限公司）；無水乙醇、正丁醇、過氧化氫（30%）、香草醛、冰醋酸、高氯酸，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲-微波協(xié)同萃取儀（CW-2000，新拓分析儀器科技有限公司）；電子天平（BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；低速臺式大容量離心機（TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；可見分光光度計（721，天津普瑞斯儀器有限公司）；水浴鍋等。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱量齊墩果酸0.005 g，用無水乙醇溶解定容至10 mL；精準(zhǔn)移取濃度為0.5 mg/mL的齊墩果酸樣品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支10 mL的試管中，水浴蒸干后分別加入0.3 mL新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液及1.0 mL高氯酸溶液，將它們置于 60 ℃ 水浴鍋中加熱20 min，取出后用流水冷卻至室溫后在試管中分別加入5.0 mL冰醋酸，搖勻。在560 nm波長處測吸光度[10-11]。以吸光度為縱坐標(biāo)、齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=0.262x+0.131 4（r2=0.998 6）。

1.3.2 枸骨葉皂苷提取流程 提取流程：枸骨葉烘干—粉碎—過60目篩—超聲-微波協(xié)同萃取儀提取枸骨中的皂苷（2次）—抽濾、合并提取液—水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)—加入正丁醇—水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)—加入過氧化氫—水浴加熱（99 ℃）—定容至10 mL得樣品溶液[12-15]。取樣品溶液0.2 mL，采用“1.3.1”節(jié)的方法測定吸光度，按上述回歸方程，計算總皂苷的含量。

提取率=m2/m1×100%。

式中：m2為提取到的枸骨總皂苷的質(zhì)量（g）；m1為枸骨葉粉末的質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗

在開啟超聲波的條件下，以乙醇體積分?jǐn)?shù)80%為溶劑[9]、固定提取時間為240 s、提取功率為 180 W，分析料液比分別為1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50、1 ∶ 60（g ∶ mL）對枸骨總皂苷提取率的影響；固定提取時間為 240 s、料液比為 1 g ∶ 30 mL，考察微波功率分別為60、120、180、240、300 W對枸骨總皂苷提取率的影響；固定提取功率為120 W、料液比為 1 g ∶ 30 mL，考察提取時間分別為120、180、240、300、360 s對枸骨總皂苷提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-benhnken Design中心組合試驗設(shè)計原理，以提取時間、提取功率、料液比為自變量，以枸骨總皂苷提取率為響應(yīng)值，設(shè)計3個因素3個水平的響應(yīng)曲面分析試驗，建立枸骨總皂苷提取工藝條件的二次模型。因素水平見表1。endprint

1.3.5 抗氧化試驗

本試驗采用的方法是通過測定皂苷清除DPPH自由基的能力判斷枸骨總皂苷的抗氧化能力[12-20]。

溶液的制備：（1）DPPH溶液的制備：取0.002 0 g DPPH固體，用95%乙醇溶液溶解，定容至25 mL搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；維生素C對照品（BTH）溶液的制備：取0.002 2 g BTH固體，用95%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

枸骨總皂苷抗氧化性試驗：吸取2 mL DPPH溶液于試管中，加入2 mL樣品溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，在517 nm波長處測定其吸光度，記為樣品吸光度DA1；取樣品溶液2 mL，加入80%乙醇溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，測其吸光度；記為干擾吸光度DA2；取2 mL 80%乙醇溶液，再加入2 mL DPPH溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，測定其吸光度，記為對照吸光度DA0。樣品設(shè)有6組濃度梯度，每組3個平行。清除率=1-（DA1-DA2）/DA0×100%。

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對照試驗：分別吸取BTH溶液2.5、33、5.0、6.6、8.3、9.1、10.0 mL用95%乙醇溶液定容至 25.0 mL，搖勻。分別取2.0 mL于具塞試管中，加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)45 min，測其吸光度，記為樣品吸光度DB1；取稀釋液各2.0 mL于具塞試管中，分別加入 2.0 mL DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)45 min，測其吸光度，記為干擾吸光度DB2；取 2.0 mL 95%乙醇溶液，再加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，測定其吸光度，記為對照吸光度DB0。清除率=1-（DB1-DB2）/DB0×100%。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.0軟件作圖，Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對枸骨總皂苷提取率的影響

在微波功率 180 W、提取時間240 s的條件下，分析不同料液比對枸骨總皂苷提取率的影響。如圖1所示，當(dāng)料液比小于1 g ∶ 30 mL時，隨著料液比的增加，枸骨總皂苷含量呈上升趨勢。提取劑的增加，更有利于枸骨總皂苷的溶出，這是因為溶劑和原料間的濃度差越大，其提取效率就越高，目標(biāo)物質(zhì)就越容易溶出，當(dāng)料液比超過1 g ∶ 30 mL時，枸骨總皂苷含量有下降的趨勢，可能是由于溶劑過大，超聲波協(xié)同微波的能量在相同時間提供的熱量被提取劑吸收的比例增加以及空化效應(yīng)和機械效應(yīng)等效應(yīng)的強度減弱等影響了提取效率。因此選擇液料比 1 g ∶ 30 mL于后面的試驗繼續(xù)考察。

2.1.2 微波功率對枸骨總皂苷提取率的影響

由圖2可知，在微波功率為120 W之前，枸骨總皂苷提取率呈上升趨勢，隨后就開始下降?？赡苡捎陔S著微波功率的增加，物質(zhì)的加熱程度也隨之增加，使枸骨總皂苷更容易被提取出來，即皂苷提取效率增加。在微波功率達到120 W之后，枸骨總皂苷提取率有減少趨勢，這可能是由于高微波功率導(dǎo)致的熱效應(yīng)使枸骨總皂苷分解。因此，120 W為最佳微波功率。

2.1.3 超聲-微波協(xié)同提取時間對枸骨總皂苷提取率的影響

由圖3可知，在超聲-微波協(xié)同提取時間為180 s之前，枸骨總皂苷不能充分地轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著提取時間的延長，枸骨總皂苷的提取率增加，在180 s時達到峰值，提取時間繼續(xù)延長，枸骨總皂苷提取率明顯下降，這可能是因為隨著微波時間的延長，溫度急劇升高，導(dǎo)致皂苷分解。因此，180 s為最佳提取時間。

2.2 響應(yīng)曲面法分析枸骨總皂苷的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)曲面法分析枸骨總皂苷的提取工藝試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取時間、微波功率和液料比為自變量，按表1中的因素、水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)曲面試驗方案。如表2所示，共17個試驗點，其中12個為析因點，5個為零點，析因點為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，其中零點試驗重復(fù)5次，用以估算試驗誤差。

2.2.2 響應(yīng)曲面法分析枸骨總皂苷提取工藝模型的建立及顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0.6軟件通過逐步回歸對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到枸骨總皂苷提取率對提取 時間、提取功率、料液比的回歸方程為

Y（%）=3.67-0038A- 0.42B+0.19C+0.006A×B-0.24A×C+0.12B×C-113A2-0.59B2-0.71C2。

對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型具有高度顯著性（P<0.01），失擬項不顯著（P=0.73），R2adj=0.912 6，R2=0.938 7，信噪比為11.910，遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高，說明這種試驗方法是準(zhǔn)確可靠的，使用該方程模擬真實的3個因素3個水平的分析是可行的。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對結(jié)果的影響排序為微波處理功率>液料比>提取時間。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為93.87%，大于90%，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型是合適的。因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下枸骨總皂苷提取率的變化。由表3的P值可知，方程中B、A2、B2、C2對枸骨總皂苷提取率Y值的影響極顯著，表明試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有很大的影響，交互項作用的影響較小。這與模擬回歸中線性和二次項影響顯著相對應(yīng)。

2.2.3 枸骨總皂苷提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)二次模型得到的等高線及響應(yīng)曲面可以評價試驗因素之間的endprint

交互作用強度，確定各因素的最佳水平范圍。從圖4至圖9中的響應(yīng)曲面最高點及其等高線可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)曲面最高點，同時也是等高線最小橢圓的中心點。

由圖4、圖5可知，當(dāng)料液比為1 g ∶ 30 mL時，在提取時間 120～180 s的范圍內(nèi)皂苷提取率先迅速增加，在180 s之后皂苷提取率有下降的趨勢。在微波處理功率60～120 W范圍內(nèi)，皂苷提取率不斷增加，之后隨著提取時間的延長，皂苷提取率有下降的趨勢。隨著提取時間和微波功率的增加，皂苷提取率先迅速增加，達到最高點之后略有下降的趨勢。

從圖6、圖7可以看出，當(dāng)微波處理功率為120 W時，隨時間的延長、液料比的增大，皂苷提取率逐漸升高，達到最高點之后有下降的趨勢。

由圖8、圖9可知，當(dāng)提取時間為180 s時，在料液比 1 g ∶ （20～30） mL范圍內(nèi)，皂苷提取率不斷增加，之后隨著微波功率的增大，皂苷提取率有下降趨勢。微波處理功率在60～120 W范圍內(nèi)，提取率不斷增加，之后隨著液料比的增大，皂苷提取率有下降趨勢。

從圖4至圖9中的響應(yīng)曲面及其等高線可以看出，等高線呈橢圓，說明提取時間和微波功率、微波功率和液料比、料液比和提取時間之間交互影響明顯，響應(yīng)曲面陡峭說明枸骨總皂苷提取率受提取時間、微波功率和料液比的變化敏感，也表明各因素對枸骨總皂苷的影響不是簡單的線性關(guān)系。

通過軟件分析，得到皂苷提取的最佳條件為提取時間179.96 s，微波處理功率98.84 W，料液比1 ∶ 30（g ∶ mL），在此條件下皂苷提取率的理論值為3.7429%。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進行皂苷提取率提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為提取時間180 s、微波處理功率100 W、料液比1 ∶ 30（g ∶ mL），5次平行試驗皂苷提取率分別為3.731 2%、3.740 8%、3.741 3%、3.744 1%、3.739 2%，平均皂苷提取率為 3.739 3%，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，偏差不大，吸光度測量值穩(wěn)定，說明每次測定的皂苷含量穩(wěn)定，證明該結(jié)果是合理可靠的。

2.3 抗氧化活性試驗

由圖10可知，枸骨總皂苷在10～65 μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著枸骨總皂苷濃度的升高，對DPPH清除率增強，當(dāng)枸骨總皂苷濃度為65 μg/mL時清除率達最大值，為25%；之后隨著枸[CM（25]骨總皂苷濃度的升高，對DPPH清除效果有下降趨勢。從

圖11可知，維生素C在低濃度的條件下即可對DPPH表現(xiàn)出很強的清除能力，當(dāng)維生素C濃度超過16 μg/mL時隨濃度的升高清除率下降。

總之，枸骨總皂苷具有較強的抗氧化能力，但它對DPPH的清除效果要小于維生素C的作用效果，這可能是因為使用枸骨總皂苷粗提物進行抗氧化試驗，含有較多的其他化合物，從而影響了其對DPPH的清除效果。

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對枸骨總皂苷超聲-微波協(xié)同提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化研究，選擇超聲-微波協(xié)同提取時間、微波功率以及料液比為自變量，總皂苷提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計方法，研究各自變量及其交互作用對總皂苷提取率的影響。利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到二次多項式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)[CM（25]果表明， 枸骨總皂苷超聲-微波協(xié)同提取的優(yōu)化工藝條件

為超聲-微波協(xié)同提取時間180 s、微波功率100 W、料液比 1 ∶ 30（g ∶ mL）。在此工藝條件下枸骨總皂苷理論提取率為3.742 9%，實測提取率為3.739 3%。張風(fēng)禮等利用浸提法，通過乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間等單因素和正交試驗法優(yōu)化枸骨葉總皂苷的提取工藝，結(jié)果以80%乙醇水溶液為溶劑，料液比1 g ∶ 10 mL，65 ℃浸提取1.5 h時總皂苷提取率高提取率達4.51%[10]。雖然利用該工藝提取枸骨葉總皂苷提取率達4.51%，但該工藝提取時間長，耗能較高，而本試驗利用超聲-微波協(xié)同提取枸骨葉總皂苷的方法具有操作簡便、提取時間短、耗能較少等特點。

枸骨葉是苦丁茶的主要源植物之一，作為日常保健飲品，具有減肥、強身健體的功效，近年來多數(shù)學(xué)者對枸骨葉藥理學(xué)進行了研究[3，6]。結(jié)果表明，枸骨葉具有抗心肌缺血、降血脂、抗菌、免疫、抑制抗生育和抗氧化等廣泛的藥理作用[20-27]。曠春桃等在新鮮肥肉熬制的豬油中分別添加自制的0.02%枸骨葉多酚類提取物，來檢測枸骨葉多酚類提取物的抗氧化能力，結(jié)果表明枸骨葉多酚類提取物能有效抑制豬油的氧化，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[19]。本試驗通過對DPPH的清除力來檢測不同濃度的枸骨總皂苷體外抗氧化活性，結(jié)果顯示枸骨總皂苷濃度為62.24 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為24.22%，進一步說明枸骨葉有較強的抗氧化能力。

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