侯澤豪+楊飛+商水根+方漢順+張文英+徐延浩

摘要： 比較1、10、20 mmol/L的丁酸鈉溶液和1 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L的5-氮雜胞苷（5-azacytidine，簡稱5-AC）溶液對大麥、水稻、玉米和小麥等4種作物種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明，丁酸鈉、5-AC處理均可抑制種子萌發(fā)、植株株高及根長的生長。受害指數(shù)分析結(jié)果表明，4種作物對5-AC處理較丁酸鈉處理敏感。從頂端生長來看，玉米對丁酸鈉處理較敏感，大麥對5-AC處理最敏感。丁酸鈉對小麥根系數(shù)目增加的促進(jìn)作用最強(qiáng)；低濃度5-AC對玉米根系數(shù)目增加的促進(jìn)作用最強(qiáng)；但高濃度5-AC抑制根系數(shù)目的增加。受害指數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，丁酸鈉、5-AC處理對植物頂端生長點(diǎn)與側(cè)向器官發(fā)生組織具有不同的影響，說明丁酸鈉、5-AC對不同的器官具有不同的表觀遺傳調(diào)控效果。

關(guān)鍵詞： 禾本科作物；丁酸鈉；5-氮雜胞苷；種子萌發(fā)；幼苗生長；受害指數(shù)

中圖分類號： S351.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0073-04

表觀遺傳是一種不涉及DNA序列改變但可以通過有絲分裂和（或）減數(shù)分裂實(shí)現(xiàn)代間傳遞的變異，這些變異主要包括組蛋白共價(jià)修飾和DNA甲基化等。表觀遺傳機(jī)制在植物發(fā)育、非生物逆境抗性等方面起著關(guān)鍵作用[1]，對油菜[2]、大麥[3]和玉米[4]種子萌發(fā)及幼苗建立階段的研究表明，種子萌發(fā)伴隨著DNA去甲基化及組蛋白乙?；降母淖儭４送?，外源激素處理通過改變種子的表觀遺傳修飾模式而影響種子的萌發(fā)[5]。由此可見，表觀遺傳修飾是控制種子萌發(fā)、生長的重要機(jī)制。

5-氮雜胞苷（5-azacytidine，簡稱5-AC）和丁酸鈉（sodium butyrate）是2種重要的表觀遺傳調(diào)控試劑。5-氮雜胞苷能降低基因組DNA甲基化水平，丁酸鈉可抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，提高組蛋白乙?；?。5-AC可調(diào)控植物的生長發(fā)育、促進(jìn)植株開花、增強(qiáng)作物的耐濕性[6]和耐鹽性[7]。5-AC對小麥[8]、白菜[9]、蘿卜[10]和菠菜[11]等植物種子的處理結(jié)果表明，5-AC可引起基因組DNA甲基化水平的下降，且其表型效應(yīng)與處理濃度相關(guān)[8]。丁酸鈉處理能促進(jìn)水稻花培綠苗的形成[12]，但不能顯著提高大麥苗期的耐濕性[6]。與5-AC相比，關(guān)于丁酸鈉對種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育影響還知之甚少，缺乏丁酸鈉與5-AC對作物種子萌發(fā)及幼苗生長效應(yīng)的系統(tǒng)對比研究。

本研究使用不同濃度的丁酸鈉溶液和5-AC溶液對大麥、水稻、玉米及小麥進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率、幼苗株高、根系發(fā)育情況以及植株的干質(zhì)量等指標(biāo)，系統(tǒng)比較這4種禾本科作物對丁酸鈉和5-AC等2種表觀遺傳試劑處理的敏感性差異，為研究DNA去甲基化、組蛋白乙?；缴邔ΨN子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的影響提供依據(jù)，為從表觀遺傳學(xué)角度探索種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育積累更多的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大麥蘇啤3號（Hordeum vulgare L. cv. Supi3）、水稻豐美占（Oryza sativa L. cv. Fengmeizhan）、玉米鄭單958（Zea mays L. cv. Zhengdan958）、小麥湘麥10號（Triticum aestivum L. cv. Xiangmai10）。供試大麥、水稻、小麥材料由筆者所在單位保存，玉米購于種子市場。

1.2 試驗(yàn)方法

選取飽滿的種子，用75%的乙醇消毒30 s，清水潤洗后置于鋪有2層濾紙的發(fā)芽盒中，分別加入不同濃度的丁酸鈉溶液和5-AC溶液，并置于人工氣候箱（上海佳語JYC-412）中暗培養(yǎng)24 h之后進(jìn)行周期性光照培養(yǎng)，光照度為 10 000 lx，光—暗周期為12 h—12 h。大麥和小麥的發(fā)芽培養(yǎng)溫度為25 ℃/20 ℃（晝/夜），玉米和水稻為35 ℃/30 ℃（晝/夜）。培養(yǎng)期間每天08：00補(bǔ)充1次相同濃度的溶液。

試驗(yàn)包括對照組（清水發(fā)芽培養(yǎng)）、5-氮雜胞苷組和丁酸鈉組。5-氮雜胞苷（A2385）和丁酸鈉（V900464）購自Sigma公司。5-氮雜胞苷（5-AC）組設(shè)置5個(gè)處理濃度，分別為 1 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L。丁酸鈉處理組設(shè)置3個(gè)處理濃度，分別為1、10、20 mmol/L。每個(gè)處理重復(fù)3次，玉米每次50粒，其他材料100粒。

1.3 測定指標(biāo)及分析方法

各試驗(yàn)材料培養(yǎng)7 d后，分別測定每個(gè)處理的發(fā)芽率（發(fā) 芽率=7 d 內(nèi)總發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%）、株高、種子根長、根系數(shù)量以及植株干質(zhì)量。鮮質(zhì)量的測定選取玉米10株，其他材料50株。測定其全株（包含已萌發(fā)的種子）鮮質(zhì)量后，105 ℃殺青15 min，60 ℃烘至恒質(zhì)量，測定植株干質(zhì)量。

表觀遺傳試劑處理對各作物、各類組織的傷害程度用表觀遺傳受害指數(shù)評價(jià)，受害指數(shù)=（對照組織數(shù)據(jù)-處理組織數(shù)據(jù)）/對照組織數(shù)據(jù)×100%。用苗高受害指數(shù)評價(jià)莖尖生長點(diǎn)的受害程度，用根長受害指數(shù)評價(jià)根尖生長點(diǎn)的受害程度，用初生根系數(shù)量評價(jià)根部的側(cè)生器官形成能力。用加權(quán)平均受害指數(shù)評價(jià)每種材料對丁酸鈉和5-AC的敏感性，加權(quán)平均受害指數(shù)={[丁酸鈉溶液/5-AC溶液濃度×對應(yīng)濃度受害指數(shù)]之和}/（丁酸鈉溶液/5-AC溶液濃度）濃度之和。用SPSS 19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、方差分析和多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸鈉和5-AC對4種禾本科作物種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，對照條件下，大麥、水稻、玉米和小麥發(fā)芽率分別為96.67%、95.67%、95.67%和96.67%。1 mmol/L的丁酸鈉溶液對這4種作物種子的發(fā)芽率沒有影響；與對照相比，10 mmol/L丁酸鈉溶液處理后4種作物的發(fā)芽率均降低，分別為90.00%、91.00%、86.67%和84.33%；20 mmol/L 丁酸鈉處理大麥、水稻、玉米和小麥的發(fā)芽率分別為84.33%、87.67%、80.00%和80.00%。結(jié)果表明，丁酸鈉濃度越高，對種子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)。

由圖2可知，1、50 μmol/L的5-AC溶液處理對4種作物的發(fā)芽率影響較?。?00 μmol/L的5-AC溶液處理，水稻的發(fā)芽率降低5.67百分點(diǎn)（P<0.05），其他作物的發(fā)芽率變化較小。1 mmol/L的5-AC溶液處理大麥、水稻、玉米和小麥的發(fā)芽率分別降低6.67、5.67、5.67、5.34百分點(diǎn)；10 mmol/L 的5-AC溶液處理這4種作物的發(fā)芽率分別降低9.00、7.00、12.34、10.00百分點(diǎn)。

2.2 丁酸鈉和5-AC對4種作物株高的影響

由圖3可知，與對照相比，1 mmol/L丁酸鈉溶液對水稻、玉米和小麥株高的生長無顯著影響，對大麥株高表現(xiàn)出促進(jìn)作用， 株高顯著增加 3.24%。 10 mmol/L 丁酸鈉溶液處理大麥、水稻、玉米和小麥株高的受害指數(shù)分別為19.08%、1756%、58.70%和33.43%；20 mmol/L丁酸鈉溶液處理4種作物株高的受害指數(shù)分別為39.83%、19.77%、74.95%和 50.93%。

由圖4可知，與對照相比，1 μmol/L的5-AC處理對4種作物的株高沒有顯著影響；50 μmol/L的5-AC處理對大麥、玉米和小麥的株高沒有顯著影響，但水稻株高顯著提高10.14%。100 μmol/L和1、10 mmol/L的5-AC處理，大麥株高受害指數(shù)分別為2.20%、9.71%和100.00%，玉米株高受害指數(shù)分別為28.38%、57.54%和76.42%。小麥僅在 10 mmol/L 的5-AC處理下株高顯著受害，受害指數(shù)為 28.97%。水稻株高在100 μmol/L和1 mmol/L的5-AC處理下與對照差異不顯著，較50 μmol/L的5-AC處理下降；在10 mmol/L的5-AC處理下的株高較對照顯著下降，受害指數(shù)為61.64%。

2.3 丁酸鈉和5-AC對4種禾本科作物根系發(fā)育的影響

由表1可知，大麥在1、10 、20 mmol/L丁酸鈉處理下，根長受害指數(shù)為9.81%、61.43%、72.15%。玉米在1、10、20 mmol/L 丁酸鈉溶液處理下根長的受害指數(shù)分別為 14.22%、42.71%、70.09%。小麥在10、20 mmol/L的丁酸鈉溶液處理下，根長受害指數(shù)分別為29.34%、63.17%。與對照相比，1 mmol/L 丁酸鈉溶液顯著促進(jìn)水稻根長的生長，根長增加19.69%，10 mmol/L丁酸鈉溶液對水稻根長沒有顯著影響，而在20 mmol/L丁酸鈉溶液處理下根長的受害指數(shù)為 18.38%。

由表1還可知，與對照相比，1 mmol/L丁酸鈉溶液處理對大麥、水稻、玉米和小麥的初生根系數(shù)量沒有顯著影響；10 mmol/L 的丁酸鈉溶液處理大麥、水稻、小麥的根系數(shù)量分別增加25.81%、16.95%和22.29%，但對玉米的根系數(shù)量沒有顯著影響；20 mmol/L 的丁酸鈉溶液處理大麥、水稻、玉米、小麥的根系數(shù)量分別增加14.52%、13.56%、9.05%和34.10%。

由表2可知，大麥和玉米根長受害程度隨著5-AC處理濃度增加而增加，濃度從1 μmol/L 到10 mmol/L，大麥根長受害指數(shù)分別為11.14%、38.82%、62.26%、73.90%和9169%，玉米根長受害指數(shù)分別為25.29%、31.69%、6262%、81.36%和90.30%。小麥根長在 1 mmol/L 的5-AC溶液處理時(shí)出現(xiàn)顯著受害情況，受害指數(shù)為25.91%；10 mmol/L 的5-AC溶液處理與1 mmol/L的 5-AC溶液處理小麥根長受害程度無顯著差異。與對照相比，1 μmol/L 至1 mmol/L的5-AC處理對水稻根長生長沒有顯著影響，10 mmol/L 的5-AC溶液處理時(shí)，根長害指數(shù)為 85.34%。

由表2還可知，當(dāng)5-AC濃度由50 μmol/L上升至 1 mmol/L 時(shí)，大麥的根系數(shù)量隨著5-AC濃度增加而增加，在1 mmol/L時(shí)根系數(shù)量達(dá)到最大，較對照增加25.97%；10 mmol/L 的5-AC處理時(shí)，大麥根系數(shù)量較其他處理顯著減少，受害指數(shù)為 47.58%。在1 mmol/L的5-AC處理時(shí)小麥的根系數(shù)量與對照相比顯著增加16.76%；在10 mmol/L的5-AC處理時(shí)，根部的側(cè)生器官形成能力受到抑制，受害指數(shù)為 12.76%。與對照相比，1 μmol/L至1 mmol/L的5-AC處理對水稻根系數(shù)量的影響不顯著，但在10 mmol/L的 5-AC處理下表現(xiàn)出顯著受害現(xiàn)象，受害指數(shù)76.27%。玉米的根系數(shù)量在5-AC各濃度處理下均無顯著變化。

2.4 丁酸鈉和5-AC對4種禾本科芽苗期生物量的影響

由表3可知，丁酸鈉對4種作物芽苗期的生長整體表現(xiàn)出抑制作用，且濃度越高抑制越強(qiáng)烈。與對照相比，1 mmol/L的丁酸鈉溶液對水稻干質(zhì)量沒有顯著影響。10 mmol/L的丁酸處理大麥、水稻、玉米和小麥干質(zhì)量的受害指數(shù)分別為2150%、12.28%、12.03%和39.11%。20 mmol/L的丁酸鈉處理4種作物干質(zhì)量的受害指數(shù)分別為31.43%、14.75%、18.20%和37.83%。與對照相比，丁酸鈉處理對4種作物幼苗的含水量無顯著影響。

由表3還可知，大麥干質(zhì)量的積累在5-AC處理下受到抑制，50、100 μmol/L和1、10 mmol/L處理下的受害指數(shù)分別為9.49%、8.72%、22.82%、90.04%。水稻的干質(zhì)量僅受 10 mmol/L 的5-AC顯著影響，受害指數(shù)為 24.69%。與對照相比，100 μmol/L和1、10 mmol/L的5-AC處理下，玉米干質(zhì)量顯著下降，受害指數(shù)分別為15.11%、19.22% 和2267%。與對照相比，小麥的干質(zhì)量在100 μmol/L、1 mmol/L 和10 mmol/L的5-AC處理下顯著下降，受害指數(shù)分別為 9.46%、13.50%和55.47%。與對照相比，5-氮雜胞苷處理也未對作物幼苗的含水量產(chǎn)生顯著影響。

2.5 4種作物對丁酸鈉和5-AC處理的敏感性與器官反應(yīng)

加權(quán)平均受害指數(shù)分析結(jié)果（表4）表明，5-AC引起的株高、根長、根系數(shù)量受害程度要明顯高于丁酸鈉處理。從株高和根長的加權(quán)平均受害指數(shù)來看，玉米對丁酸鈉處理最敏感，其次是小麥、大麥，水稻對丁酸鈉處理的耐受最強(qiáng)；大麥對5-AC處理最敏感，其次是玉米、水稻，小麥對5-AC處理的耐受最強(qiáng)。從根系數(shù)量的加權(quán)平均受害指數(shù)來看，丁酸鈉對小麥的側(cè)向器官發(fā)生的促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次是大麥和水稻，并且影響程度相當(dāng)； 5-AC對玉米、小麥、大麥和水稻的影響主要表現(xiàn)為抑制側(cè)向器官的發(fā)生。

對單苗干質(zhì)量受害指數(shù)與株高、根長和根系數(shù)量的受害程度的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表5）表明，丁酸鈉處理單苗干質(zhì)量受害指數(shù)與株高、根長呈正相關(guān)關(guān)系，而與根系數(shù)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。除玉米根系數(shù)量外，5-AC處理單苗干質(zhì)量與株高、根長和根系數(shù)量均呈正相關(guān)關(guān)系。玉米的根系數(shù)量與5-AC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)較低，僅為-0.167 9。結(jié)果表明，丁酸鈉和5-AC對植物頂端生長點(diǎn)與側(cè)向器官發(fā)生組織具有不同的影響。

3 結(jié)論與討論

丁酸鈉是一種表觀遺傳調(diào)控試劑，但關(guān)于丁酸鈉對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)效應(yīng)報(bào)道較少。結(jié)果表明，丁酸鈉和5-AC處理整體上抑制株高增加、根系伸長以及干物質(zhì)的積累，丁酸鈉處理對根系數(shù)量的發(fā)生有一定的促進(jìn)效果，但 5-AC處理表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)根系數(shù)量的發(fā)生，而高濃度抑制根系數(shù)量的發(fā)生。說明丁酸鈉和5-AC這2種表觀遺傳試劑在種子萌發(fā)過程引起的表型效應(yīng)具有相似性，但在植物頂端生長點(diǎn)與側(cè)向器官發(fā)生組織中的作用存在差異。前人的研究發(fā)現(xiàn)，5-AC對植物生長發(fā)育的調(diào)控效應(yīng)與其處理濃度有關(guān)[8-10]。通過5個(gè)處理濃度的5-AC對4種禾本科作物進(jìn)行比較也進(jìn)一步證實(shí)5-AC對植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)具有濃度效應(yīng)。低濃度的5-AC對作物某些器官的發(fā)生具有促進(jìn)效應(yīng)，而高濃度的5-AC對某些器官的發(fā)生具有抑制作用。丁酸鈉和5-AC處理均抑制株高、根系的生長及干物質(zhì)的積累，但5-AC的危害較重；丁酸鈉溶液處理能促進(jìn)作物根系數(shù)量的發(fā)生，而5-AC處理后的促進(jìn)效應(yīng)明顯不如丁酸鈉處理。由此可見，丁酸鈉和 5-AC對植物的調(diào)控效應(yīng)并不完全相同。

通過本試驗(yàn)結(jié)果可推測，丁酸鈉溶液和低濃度的5-AC可能通過抑制根尖生長點(diǎn)和莖尖生長點(diǎn)細(xì)胞的生長和分化，促進(jìn)側(cè)向器官組織細(xì)胞的活動(dòng)。丁酸鈉抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，提高組蛋白乙?；剑瑥亩せ罨虮磉_(dá)[13]。有研究認(rèn)為，丁酸鈉也能降低基因組甲基化水平，激活基因表達(dá)[14]。一般認(rèn)為，5-AC能降低基因組DNA甲基化水平，從而激活基因的表達(dá)[15]。此前，5-AC對植物的生長發(fā)育效應(yīng)[8，10-11]、促進(jìn)植物開花[15]、提高植物抗逆性[7]方面已經(jīng)有了一些研究，結(jié)果顯示，植物基因組的甲基化水平有所下降。但關(guān)于5-AC在不同組織中的效應(yīng)報(bào)道較少。Kruh認(rèn)為，丁酸鈉能作用于不同位置的細(xì)胞，但專一性很低[16]。從本研究結(jié)果來看，丁酸鈉對不同位置細(xì)胞具有不同的調(diào)控效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度5-AC處理對莖尖生長點(diǎn)和側(cè)向器官形成細(xì)胞具有不同的調(diào)控效應(yīng)，而高濃度的 5-AC 抑制了側(cè)向器官的形成。因此，丁酸鈉和5-氮雜胞苷對不同組織的調(diào)控效應(yīng)有待進(jìn)一步深入研究。

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