雷雨+張雪芳+羅鑫磊+劉咲頔+熊怡+馮濤

摘要： 從11個(gè)桃品種嫩葉中分別提取基因組DNA，根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫中NAC基因序列信息，設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物克隆測序。然后，使用DNAman軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對，使用ORF Finder獲得開放閱讀框和推導(dǎo)氨基酸序列，使用CDD工具進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，利用Blastp工具搜索同源蛋白，采用Mega軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC蛋白第16～140位存在1個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域，N端比較保守，C端則多樣性比較高；核苷酸變異有SNP和Indel 2類，津柳早紅和小白桃在第3外顯子區(qū)SNP和Indel變異數(shù)量非常多，說明這2個(gè)品種的NAC基因結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性。蛋白比對發(fā)現(xiàn)，桃NAC與梅同源性最高，其次是鴨梨；進(jìn)化樹體現(xiàn)了物種的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，參試品種NAC基因存在比較豐富的遺傳多樣性，在保守區(qū)內(nèi)的氨基酸變異可能影響蛋白的功能。

關(guān)鍵詞： 桃；NAC轉(zhuǎn)錄因子；成熟期；保守區(qū)；系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號： S662.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0046-04

NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，1996年Souer等首先從矮牽牛中克隆得到[1]，隨后在擬南芥、水稻、小麥、大豆等中相繼發(fā)現(xiàn)。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、激素調(diào)節(jié)以及對生物和非生物逆境的抗性等方面發(fā)揮作用[2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，由約150個(gè)氨基酸殘基組成；C末端通常有簡單的重復(fù)氨基酸序列，富含絲氨酸，蘇氨酸、脯氨酸和谷氨酸，或者酸性氨基酸殘基，具有轉(zhuǎn)錄激活功能。

有研究者指出NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物生殖器官成熟和衰老。2006年，Uauy等從小麥中分離了NAM-B 1，功能分析顯示，它在野生小麥中加速植株衰老，促進(jìn)葉片中營養(yǎng)物質(zhì)向籽粒流動(dòng)[3]。2011年，Balazadeh等從擬南芥中分離了ORS1，超表達(dá)ORS1轉(zhuǎn)化擬南芥，加速了轉(zhuǎn)化體衰老[4]。2013年，Zhou等從水稻中鑒定出OsNAP，發(fā)現(xiàn)它調(diào)控葉片衰老[5]。2014年，Kim等在擬南芥上發(fā)現(xiàn)NAC有調(diào)控衰老的功能[6]。2013年，Pirona等利用桃Contender×Ambra和NJWeeping×Bounty F2代分離群體、SNP檢測、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、對候選基因的Sanger測序等技術(shù)，結(jié)合檢測等位基因在子代中的分離比例等，認(rèn)為NAC基因在控制桃果實(shí)成熟期中發(fā)揮重要作用[7]。筆者前期克隆了小白桃和它的早熟芽變品種津柳早紅的NAC基因，發(fā)現(xiàn)二者核酸序列有多處差異，尤其是后者中核苷酸變異形成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止（未發(fā)表資料）。那么，在其他不同成熟期的桃品種中，NAC基因結(jié)構(gòu)是否存在多樣性？為了解答這個(gè)問題，筆者從11桃品種中克隆了NAC基因，希望通過分析其結(jié)構(gòu)，能找到一些NAC發(fā)揮功能的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年6月從天津?qū)W香果蔬有限公司（位于天津市西青區(qū)楊柳青鎮(zhèn)大柳灘村）桃資源圃采集津柳早紅、萬壽紅等11個(gè)桃品種（表1）的嫩葉，液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的復(fù)雜植物基因組DNA提取試劑盒基因組DNA。使用Nanodrop 2000檢測核酸純度和濃度。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸完整性、潔凈度和有無其他類型核酸污染。保留純度和濃度符合要求的樣品，分別于-20 ℃保存。

1.3 NAC基因的PCR擴(kuò)增及測序

從GDR數(shù)據(jù)庫（https：//www.rosaceae.org）獲取桃NAC基因序列信息，對5′UTR、外顯子區(qū)和3′UTR，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL包括10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL（2.5 mmol/L），模板cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（20 μmol/L），Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL（5 U/μL），其余用PCR級純水補(bǔ)充。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸 2 min）；最后72 ℃延伸8 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，目的條帶回收、純化（Takara膠回收試劑盒），連接至pMD18-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆、搖菌，選取陽性克隆，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 核酸序列比對和生物信息學(xué)分析

使用DNAman 5.2軟件進(jìn)行核酸序列比對，結(jié)合參考基因組中NAC基因序列，區(qū)別各品種NAC基因的外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)；使用ORF Finder在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）獲得開放閱讀框和推導(dǎo)氨基酸序列；使用NCBI中的CDD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。

1.5 NAC同源蛋白及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NCBI中的Blastp工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索同源蛋白序列；使用DNAman進(jìn)行序列比對；使用Mega 4.1軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC基因的克隆及測序

根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫中桃NAC基因（ppa008301m）mRNA序列設(shè)計(jì)特異引物對：Forward primer為ATCCCTCTCTTTCTTTC TCTC，Reverse primer為ACCCCTACTCGATTTCTCCAC。以各品種基因組DNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測得到約 1 400 bp 片段（圖1、圖2）。將上述產(chǎn)物克隆測序，分別獲得各品種NAC基因的核苷酸序列。

2.2 NAC基因的結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性

將NAC基因的DNA和cDNA序列進(jìn)行比對，分析ORF和保守區(qū)。結(jié)果顯示，各品種的NAC基因編碼氨基酸157～385個(gè)，在氨基酸序列第16～140位存在1個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域，確認(rèn)了NAC基因身份。DNA和cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，它由5′UTR區(qū)、3個(gè)外顯子區(qū)、2個(gè)內(nèi)含子區(qū)和3′UTR區(qū)組成；在各區(qū)域均存在一定數(shù)量的變異（表2）：變異分為SNP和Indel 2類；第1外顯子區(qū)有1處SNP，但它為同義突變，沒有引起氨基酸序列變化；第2外顯子區(qū)存在3處SNP，其中津柳早紅品種（代號11）的第470位核苷酸為C，其他10個(gè)品種均為A，該SNP使氨基酸126位的賴氨酸變?yōu)榫彼幔↘→R）（圖3-B），其余2處未引起氨基酸序列變化。第3外顯子區(qū)變異最多（圖3-A），非同義突變數(shù)量也最多，其中品種8在1 052～1 150位有一段99 bp的插入序列，引起插入33個(gè)氨基酸殘基；津柳早紅在559～560位有TT缺失，造成移碼突變，另外在569位有SNP，由T變G，出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致翻譯終止（圖3-C）。津柳早紅和小白桃（代號10）在第3外顯子區(qū)SNP和Indel變異數(shù)量非常多（圖3-A），說明這2個(gè)品種的NAC基因結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性。

2.3 桃NAC同源蛋白及其系統(tǒng)進(jìn)化分析

Blastp檢索同源蛋白，發(fā)現(xiàn)結(jié)果中絕大多數(shù)屬于NAC類成員。桃NAC基因與梅同源性最高，為97%，其次是鴨梨NAC，為89%。其他同源性較高的來自于蘋果、月季、湖北海棠、草莓等物種。將score值最高的19個(gè)同源蛋白序列（表3）下載到本地，進(jìn)行同源性分析（圖3-E）。桃NAC（ref品種）與19種植物同源性在72%～97%之間。

這些NAC同源蛋白比對結(jié)果顯示，在NAC結(jié)構(gòu)域保守性較高（圖3-E），在它之外則多態(tài)性較高。將桃各品種NAC氨基酸序列比對結(jié)果與其他物種同源序列比對結(jié)果結(jié)合起來分析發(fā)現(xiàn)：這些物種在126位（按照ref品種序列）賴氨[CM（25]酸高度保守，而津柳早紅品種突變?yōu)榫彼幔▓D3-B、圖3-E），且其他參試品種均為賴氨酸；在191位絲氨酸高度保守，而早蟠品種為脯氨酸（圖3-C、圖3-F），且其他參試品種均為絲氨酸；在291～318位高度保守，而小白桃品種氨基酸中發(fā)生突變較多（圖3-D、圖3-G）。

Mega 4.1生成系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），各物種NAC分為3組，桃NAC與梅、鴨梨、栽培蘋果、湖北海棠、野草莓亞種、月季、川桑等聚為一組；可可、樹棉、雷蒙德氏棉、陸地棉、葡萄、胡麻等為一組；橙、克萊門柚、麻風(fēng)樹、歐洲水青岡等為一組。桃NAC與梅NAC72聚為一小支，與同源性分析結(jié)果一致。進(jìn)化樹體現(xiàn)了親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，如雷蒙德氏棉、陸地棉聚為一支，橙、克萊門柚聚為一支，薔薇科果樹及木本觀賞植物形成一組等。

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)，NAC蛋白N端含有NAC結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列比較保守，C端則含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，多樣性比較高。本研究對不同果實(shí)成熟期的桃品種NAC蛋白氨基酸序列比對結(jié)果符合上述規(guī)律：在第1、2外顯子區(qū)核苷酸變異少，其中多數(shù)是同義突變，不引起氨基酸序列變化；第3外顯子區(qū)多樣性非常豐富，而且引起的氨基酸序列變化比較多。本研究比對20個(gè)物種的NAC同源蛋白，發(fā)現(xiàn)N端氨基酸序列比較保守，而C端多樣性較高，與前人在其他物種上的研究結(jié)論一致。津柳早紅品種NAC蛋白翻譯提前終止，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活區(qū)部分缺失，可能會(huì)影響其生物學(xué)功能或效能，進(jìn)而引起果實(shí)提早成熟，但是需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。小白桃在C端存在一段特殊的氨基酸序列，有別于其他參試桃品種，具有獨(dú)特性。

Ooka等認(rèn)為在NAC保守結(jié)構(gòu)域中包含5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（A、B、C、D、E），其中A、C、D高度保守，B和E保守性不強(qiáng)[8]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在NAC蛋白中個(gè)別氨基酸突變會(huì)顯著影響其生物學(xué)功能。在擬南芥cuc1突變體中，cuc1-1蛋白在123位氨基酸處由賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸（屬于D亞結(jié)構(gòu)域），可能影響它核定位和DNA結(jié)合，致使突變體不能形成莖頂端分生組織[2，9]。本研究中，NAC同源蛋白在126位（按照ref品種序列）賴氨酸高度保守（屬于D亞結(jié)構(gòu)域），而津柳早紅品種為精氨酸；在191位絲氨酸高度保守，而早蟠品種為脯氨酸，從類型上講，從極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸，性質(zhì)變化比較大。因此，這2處變異很有可能導(dǎo)致蛋白功能或效能的明顯變化。

不同物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析通常能獲得與基于表型性狀的植物分類學(xué)相同或相近的結(jié)果。張亮等研究了新疆栽培扁桃CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因，在對不同植物CBF氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，它與甜櫻桃、梅親緣關(guān)系最近，而且三者與野生扁桃、山桃、桃、光核桃、新疆桃等聚成一組[10]。陳清等研究黑莓RuMYB10 基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析同源蛋白發(fā)現(xiàn)，同屬懸鉤子屬的歐洲紅樹莓與RuMYB10 分化時(shí)間很近；物種間MYB基本等同于物種分類地位：同屬薔薇科的蘋果亞科、李（梅）亞科和薔薇亞科各自聚為小枝后匯為一大類[11]。本研究中，NAC同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹也體現(xiàn)了植物親緣關(guān)系，桃NAC與梅NAC72聚為一小枝，雷蒙德氏棉、陸地棉聚為一枝，橙、克萊門柚聚為一枝，薔薇科植物聚成一組等。

NAC基因是桃果實(shí)成熟期性狀的候選基因之一[7]。Eduardo等利用桃分離群體研究發(fā)現(xiàn)緩慢成熟性狀是單基因控制，它與果實(shí)成熟期性狀共分離，從NAC基因中開發(fā)了一個(gè)SCAR標(biāo)記（PSR2）用于鑒定后代成熟性狀[12]。Nuez-Lillo等利用桃F2群體研究發(fā)現(xiàn)，NAC與緩慢成熟性狀共分離，認(rèn)為NAC和ERF4 是成熟期性狀和果肉粉狀性狀的候選基因[13]。

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