李文全，曹忠勝△，錢 偉

(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，江蘇蘇州 215000；2.鎮(zhèn)江第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

論著·基礎(chǔ)研究

姜黃素對人鼻咽癌CNE-2細胞增殖及凋亡的影響*

李文全1，曹忠勝1△，錢 偉2

(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，江蘇蘇州 215000；2.鎮(zhèn)江第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

目的探討姜黃素對人鼻咽癌(NPC)CNE-2細胞增殖及凋亡的影響。方法不同濃度(0、10、20、40、60 μmol/L)姜黃素處理NPC細胞株CNE-2，利用噻唑藍(MTT)實驗檢測CNE-2細胞增殖活性，利用流式細胞儀檢測CNE-2細胞周期及凋亡率，利用Hoechest33258熒光染色法觀察細胞凋亡情況。結(jié)果姜黃素可明顯抑制CNE-2細胞增殖作用，且隨姜黃素濃度增加，CNE-2細胞抑制率呈上升趨勢(P<0.05)，姜黃素作用CNE-2細胞24、48、72 h的半抑制濃度(IC50)分別為(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L，即姜黃素可明顯抑制CNE-2細胞增殖作用，且呈現(xiàn)明顯濃度、時間依賴性；流式細胞檢測結(jié)果顯示，0、10、20、40、60 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞，凋亡率隨著姜黃素濃度增加而上升；熒光染色結(jié)果可見，CNE-2細胞未給予姜黃素處理，細胞呈圓形或者橢圓形，細胞核大小均勻一致，染色質(zhì)分布均勻的淡藍色熒光；10 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞胞體縮小，細胞核染色質(zhì)凝聚，呈顆粒狀亮藍色熒光；20 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞出現(xiàn)胞體縮小，細胞核濃縮、染色質(zhì)不均勻，出現(xiàn)凋亡小體，甚至出現(xiàn)核碎裂；40和60 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞凋亡小體數(shù)量增多，出現(xiàn)大量核碎裂。結(jié)論姜黃素對NPC細胞株CNE-2細胞增殖具有明顯抑制作用，且促進CNE-2細胞凋亡。

姜黃素；鼻咽腫瘤；CNE-2細胞；細胞增殖；凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國最為常見的惡性腫瘤之一，在我國南方地區(qū)發(fā)病率較高[1-2]。NPC由于組織結(jié)構(gòu)特殊，生長位置較深，常不易發(fā)現(xiàn)，且手術(shù)切除困難，臨床上主要以高劑量放化療為主要治療手段[3]。但是放化療在起到一定治療效果的同時，也給患者帶來了巨大的痛苦及不良反應(yīng)，長時間放化療還可導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，因此，開發(fā)新的高效低毒治療藥物仍是目前治療NPC的關(guān)鍵。姜黃素因具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[4]，是目前抗腫瘤藥物研究的熱點。大量研究表明，姜黃素對胃癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤具有明顯的抑制作用[5]。本研究旨在探討姜黃素對NPC細胞株CNE-2細胞增殖及凋亡的影響，為姜黃素治療NPC的可行性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 NPC細胞株CNE-2細胞，購自中國科學(xué)院腫瘤細胞庫。

1.1.2主要儀器與試劑 姜黃素、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)試劑盒(美國Sigma公司)，新生小牛血清、RPM11640培養(yǎng)基(杭州四季青生物公司)，細胞周期及凋亡檢測試劑盒(碧云天生物研究所)，Hoechest33258熒光染料(美國Biotium公司)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理 將NPC細胞株CNE-2細胞接種于RPM11640培養(yǎng)基中(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)，每24～48小時更換培養(yǎng)液，經(jīng)過3次傳代穩(wěn)定后，取對數(shù)生長期細胞進行實驗研究。配制0、10、20、40、60 μmol/L的姜黃素分別作用于CNE-2細胞24、48、72 h。

1.2.2MTT實驗 利用MTT實驗檢測不同濃度姜黃素處理后對CNE-2細胞增殖的影響，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進行。細胞增殖抑制率=(1-處理組吸光度值/對照組吸光值)×100%，半抑制濃度(IC50)為細胞增殖抑制率達50%時的藥物濃度。

1.2.3流式細胞儀檢測CNE-2細胞周期及凋亡率 利用FACSCalibur流式細胞儀檢測CNE-2細胞周期及凋亡率情況，具體操作嚴(yán)格按照儀器及試劑盒使用說明進行。

1.2.4Hoechest33258熒光染色 利用Hoechest33258/碘化丙錠(PI)熒光染色法觀察細胞凋亡情況，倒置熒光顯微鏡下觀察CNE-2細胞的形態(tài)。以彌散均勻藍色熒光者為CNE-2活細胞，細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)致密濃染顆粒狀熒光者為凋亡細胞，計算CNE-2細胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素對CNE-2細胞增殖作用的影響 10、20、40、60 μmol/L姜黃素可明顯抑制CNE-2細胞增殖作用，且隨姜黃素濃度增加，CNE-2細胞抑制率呈上升趨勢(P<0.05)；姜黃素作用CNE-2細胞24、48、72 h的IC50分別為(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L，見表1、圖1。

2.2姜黃素對CNE-2細胞凋亡的影響 流式細胞檢測結(jié)果顯示，0、10、20、40及60 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，CNE-2細胞凋亡率隨著姜黃素濃度增加而上升，其中40 μmol/L和60 μmol/L姜黃素作用條件下細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3姜黃素對CNE-2細胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 熒光染色結(jié)果可見，未經(jīng)姜黃素(0 μmol/L)處理CNE-2細胞培養(yǎng)24 h后，細胞呈圓形或者橢圓形，細胞核大小均勻一致，染色質(zhì)分布均勻的淡藍色熒光；10 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞胞體縮小，細胞核染色質(zhì)凝聚，呈顆粒狀亮藍色熒光；20 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞出現(xiàn)胞體縮小，細胞核濃縮、染色質(zhì)不均勻，出現(xiàn)凋亡小體，甚至出現(xiàn)核碎裂；40、60 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞凋亡小體數(shù)量增多，出現(xiàn)大量核碎裂，見圖3。

A：姜黃素處理CNE-2細胞的生長抑制曲線；B：姜黃素處理CNE-2細胞不同時間IC50；*：P<0.05；**：P<0.01

圖1 姜黃素對CNE-2細胞增殖的影響表1 不同濃度姜黃素處理CNE-2細胞的抑制率

*：P<0.05，與0 μmol/L比較；#：P<0.05，與10 μmol/L比較；△：P<0.05，與20 μmol/L比較

*：P<0.05；**：P<0.01

圖2姜黃素對CNE-2細胞凋亡的影響

→:指向凋亡小體

圖3不同濃度姜黃素對CNE-2細胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

3 討 論

NPC是指發(fā)生于鼻咽腔頂部及側(cè)壁的頭頸部惡性腫瘤[6]，是我國高發(fā)性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居耳鼻咽喉惡性腫瘤首位。NPC臨床上以鼻塞、涕中帶血、聽力下降、耳悶堵感、頭痛、復(fù)視等為主要癥狀，由于其解剖結(jié)構(gòu)較為特殊，手術(shù)治療難度較大，臨床上常采用放射治療為其首選治療方法[7]。放射治療在取得一定療效的同時，給患者帶來了極大的痛苦及不良反應(yīng)，且存在一定的局部病灶殘留，20%～30%患者經(jīng)放射治療后存在局部或者頸部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，可見放射治療對于NPC仍存在較高的失敗率。因此，尋找高效、低毒、特異的治療性藥物是目前NPC治療亟待解決的主要問題之一。

中藥以其安全性高、治療多靶點、毒性小等特點在臨床抗腫瘤治療中得到了廣泛應(yīng)用，發(fā)掘新的有效中藥活性成分是目前腫瘤治療的潛在策略。姜黃素是姜科姜黃屬植物根莖中所提取的多酚化合物，因具有抗炎、抗氧化、抗細菌、抗病毒、抗腫瘤等作用，成為了近年來國內(nèi)外研究的熱點[8-10]。1985年有學(xué)者提出姜黃素具有抗腫瘤作用，此后多項研究證實，姜黃素可通過調(diào)控腫瘤細胞生長信號傳導(dǎo)通路、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成及增加腫瘤細胞對放射治療敏感性等發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。抑制腫瘤細胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的共同途徑。劉斌等[12]研究表明，姜黃素可誘導(dǎo)人黑色素瘤細胞發(fā)生凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用；郭立達等[13]研究提出，姜黃素可明顯抑制人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；李會宣等[14]提出姜黃素可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞凋亡。有關(guān)姜黃素對人NPC細胞增殖及凋亡影響的研究較少，本研究選用國內(nèi)臨床最為常見的NPC低分化鱗癌細胞株CNE-2為研究對象，探究姜黃素對其增殖及凋亡的影響。

本研究結(jié)果表明，姜黃素可顯著抑制CNE-2細胞增殖作用，且隨姜黃素濃度增加，CNE-2細胞抑制率呈上升趨勢，姜黃素作用CNE-2細胞24、48、72 h的IC50分別為(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L，提示姜黃素可顯著抑制CNE-2細胞增殖，且呈現(xiàn)明顯的濃度、時間依賴性；流式細胞檢測結(jié)果顯示，姜黃素處理CNE-2細胞后細胞凋亡率增加，提示一定濃度姜黃素可明顯誘導(dǎo)CNE-2細胞凋亡，且隨著姜黃素濃度增加，CNE-2細胞凋亡率呈現(xiàn)明顯升高趨勢；熒光染色結(jié)果可見，未經(jīng)姜黃素處理CNE-2細胞培養(yǎng)24 h后，細胞呈圓形或者橢圓形，細胞核大小均勻一致，染色質(zhì)分布均勻的淡藍色熒光；10 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞胞體縮小，細胞核染色質(zhì)凝聚，呈顆粒狀亮藍色熒光；20 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞出現(xiàn)細胞胞體縮小，細胞核濃縮、染色質(zhì)不均勻，出現(xiàn)凋亡小體，甚至出現(xiàn)核碎裂；40、60 μmol/L姜黃素處理CNE-2細胞24 h后，細胞凋亡小體數(shù)量增多，出現(xiàn)大量核碎裂，細胞形態(tài)學(xué)改變是細胞凋亡的典型特征，證實姜黃素可誘導(dǎo)CNE-2細胞凋亡，且一定濃度范圍內(nèi)，隨姜黃素濃度的增加，CNE-2細胞凋亡逐漸增強。

綜上所述，姜黃素對NPC細胞株CNE-2細胞增殖具有明顯的抑制作用，且誘導(dǎo)CNE-2細胞凋亡，為姜黃素應(yīng)用于NPC治療提供了一定的理論依據(jù)。細胞凋亡是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，姜黃素誘導(dǎo)CNE-2細胞凋亡的作用機制，仍有待進一步深入研究。

[1]馬駿．鼻咽癌治療的研究進展[J]．中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2010，31(2)：179-185．

[2]魏礦榮，余元龍，楊有業(yè)，等．中國鼻咽癌流行概況[J]．實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17(4)：828-830．

[3]尤茜，楊玉成．放化療聯(lián)合治療局部晚期鼻咽癌的臨床研究[J]．臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28(6)：376-380．

[4]畢文杰，穆小靜，祖麗皮艷·阿布力米特，等．姜黃素新型靶向制劑研究進展[J]．中國藥學(xué)雜志，2015，50(4)：323-329．[5]范昊寧，佟麗，范欽．姜黃素對腫瘤的抑制和放射增敏作用研究進展[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(3)：333-335．

[6]Zada G，Lopes MBS，Mukundan S，et al．Nasopharyngeal carcinoma and squamous cell carcinoma of the paranasal sinuses[M]//Zada G，Lopes M，Mukundan Jr S，et al．Atlas of Sellar and Parasellar Lesions．Springer International Publishing，2016：359-365．

[7]Blanchard P，Lee A，Marguet S，et al．Chemotherapy and radiotherapy in nasopharyngeal carcinoma:an update of the MAC-NPC meta-analysis[J]．Lancet Oncol，2015，16(6)：645-655．

[8]向鑫，袁繼超，陳飛，等．姜黃素誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞促進大鼠脊髓損傷后功能修復(fù)[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2014，36(9)：883-887．

[9]汪叢叢，莊靜，馮福彬，等．姜黃素抑制肺癌細胞血管擬態(tài)形成機制探討[J]．中華腫瘤防治雜志，2015，22(4)：243-246．

[10]Yadav VR，Prasad S，Kannappan R，et al．Cyclodextrin-complexed curcumin exhibits anti-inflammatory and antiproliferative activities superior to those of curcumin through higher cellular uptake[J]．Biochem Pharmacol，2010，80(7)：1021-1032．

[11]姚慶華，林妙，汪玉琪，等．氧化應(yīng)激在姜黃素誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡中的作用及機制研究[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2016，31(2)：614-618．

[12]劉斌，鄧辰亮，楊松林，等．姜黃素對人黑色素瘤細胞凋亡機制探討[J]．中華腫瘤防治雜志，2014，21(14)：1059-1062．

[13]郭立達，焦振霞，宋瑛，等．姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細胞凋亡的作用及機制研究[J]．中國中藥雜志，2013，38(13)：2191-2196．

[14]李會宣，楊虹，張紅兵，等．姜黃素通過MAPK信號通路誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞凋亡[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26(3)：329-334．

EffectsofcurcuminonproliferationandapoptosisofhumannasopharyngealcarcinomacelllineCNE-2*

LiWenquan1,CaoZhongsheng1△,QianWei2

(1.DepartmentofENT,theSecondAffiliatedHospital,SuzhouUniversity,Suzhou,Jiangsu215000,China;2.DepartmentofENT,ZhenjiangMunicipalFirstPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE-2.MethodsThe CNE-2 cells were treated by by different concentrations (0,10,20,40,60 μmol/L) of curcumin.The proliferation activity of CNE-2 cells was detected by MTT assay,the cell cycle and apoptosis rate of CNE-2 were detected by using the flow cytometry (FCM),and the apoptosis was observed by Hoechest33258 fluorescence staining.ResultsCurcumin could significantly inhibit the proliferation of CNE-2 cells,moreover which was increased with curcumin concentration increase,the inhibitory rate of CNE-2 cells showed an increasing trend (P<0.05),the half inhibitory concentrations (IC50) of curcumin acting on CNE-2 cells at 24,48,72 h were (23.54±0.36),(18.31±0.42) and (8.56±0.37)μmol/L respectively.Curcumin could significantly inhibit the proliferation effect of CNE-2 cells,showing the apparent concentration and time dependence.The FCM detection results showed that in treating CNE-2 cells by 0,10,20,40,60 μmol/L of curcumin,the apoptosis rate was increased with the curcumin concentration increase;the fluorescence staining results showed that CNE-2 cells without curcumin treatment were round or oval,the cell nucleis were uniform in size,chromatin distribution showed the homogeneous light blue fluorescence;after 24 h of 10 μmol/L curcumin treatment,the CNE-2 cell body was shrunk and cell nuclear chromatin was condensed,showing granular bright blue fluorescence;after 24 h of 20 μmol/L curcumin treatment,the cell body was shrunk,nuclear was condensed,chromatin was uneven,apoptotic bodies appeared,and even the nuclear fragmentation appeared;after 24 h of 40 μmol/L and 60 μmol/L curcumin treatment,the number of apoptotic cells was increased,a large number of nuclear fragmentation appeared.ConclusionCurcumin has a significant inhibitory effect on the proliferation of NPC cell line CNE-2,moreover promotes the apoptosis of CNE-2 cells.

curcumin；nasopharyngeal neoplasms；CNE-2 cells；cell proliferation；apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.006

2011年江蘇省六大人才高峰項目(2011-021)；江蘇省蘇州市科技局資助項目(SYS201233)。

李文全(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事耳鼻喉喉頭頸外科疾病治療研究?！?/p>

，E-mail：cao40181@163.com。

R739.63

A

1671-8348(2017)35-4917-03

2017-07-21

2017-10-02)