洪燕婷，汪少蕓，黃茂坤，薛雅茹，林志杰

食品源魚皮明膠抗凍多肽的酶解工藝

洪燕婷1，汪少蕓2，黃茂坤1，薛雅茹1，林志杰1

以食品源魚皮明膠為原料，采用水浴酶解法制備天然抗凍多肽，以水解制備的多肽對(duì)過(guò)氧化氫酶的低溫保護(hù)活性為指標(biāo)，獲得最適蛋白酶并優(yōu)化酶解工藝條件.結(jié)果表明，酶解食品源魚皮明膠制備天然抗凍多肽效果最優(yōu)的為酸性蛋白酶，正交實(shí)驗(yàn)獲得可控制備最優(yōu)條件為酶解溫度35℃，酶解時(shí)間0.5h，酶解pH3.5，底物比1∶40，此條件制備的抗凍多肽對(duì)過(guò)氧化氫酶的低溫保護(hù)活性最佳.

抗凍多肽；魚皮明膠；酶解工藝

抗凍蛋白是一類在結(jié)冰或亞結(jié)冰條件下，可以抑制冰晶生長(zhǎng)，能保護(hù)生物有機(jī)體免受冰凍傷害，并以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)影響甚微，從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值并具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱［1］.科學(xué)家最早從極地魚類中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白，而后在真菌、細(xì)菌、昆蟲、蜘蛛和植物等中也發(fā)現(xiàn)多種抗凍蛋白，發(fā)展至今也可以通過(guò)低溫選育、低溫或脫落酸誘導(dǎo)、基因工程等手段獲得［2，3］.但大部分來(lái)源于極地嚴(yán)寒地區(qū)的生物物種數(shù)量十分有限，而通過(guò)基因工程獲得抗凍蛋白質(zhì)的技術(shù)仍然處于發(fā)展階段，且其安全性有待驗(yàn)證，這些因素很大程度上限制了抗凍蛋白質(zhì)在食品工業(yè)的應(yīng)用.目前已有學(xué)者以食品源的食用明膠為原料進(jìn)行酶解獲得抑制冰晶生長(zhǎng)的食品源抗凍多肽，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數(shù)量的局限性以及國(guó)際FDA組織對(duì)轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應(yīng)用中的安全性顧慮［4-5］.

如何克服天然抗凍蛋白數(shù)量的局限性和轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白的安全性顧慮是目前抗凍蛋白研究遇到的棘手問(wèn)題，也是抗凍蛋白在實(shí)際應(yīng)用中必須解決的難題.而抗凍多肽具有抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的特點(diǎn)、與抗凍蛋白一樣的抗凍效果及相似的抗凍機(jī)理［6］，完全可以作為抗凍蛋白的升級(jí)版，其來(lái)源更加廣泛且易得，生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，投入工業(yè)化生產(chǎn)及廣泛應(yīng)用的可能性非常大.

本文選用食品源魚皮明膠作為原料，采用酶解方式制備抗凍多肽，尋找抗凍效果最優(yōu)蛋白酶，并探究酶解工藝的最佳條件.

1 材料和儀器

1.1 材料

食品級(jí)魚皮明膠，青海明膠股份有限公司；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，食品級(jí)，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；過(guò)氧化氫酶，生化級(jí)，SIGMA-ALDOICH，其他試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純.

1.2 主要儀器

FD-1C-80真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AL104-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20酸度計(jì)，丹佛儀器（北京）有限公司；JCW-F080冰箱，廣紳商用電器有限公司；ISO8655移液槍，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；HJ—4D磁力恒溫水浴鍋，金壇市良友儀器有限公司.

2 試驗(yàn)方法

2.1 抗凍活性檢驗(yàn)方法

研究表明，抗凍蛋白對(duì)于酶具有低溫保護(hù)作用，通過(guò)測(cè)定酶在凍融前后的酶活力可檢測(cè)抗凍蛋白的抗凍活性［7］.參考李曉坤等［8］的方法并作適當(dāng)修改，用pH 7.0，0.05 M KH2PO4-NaOH緩沖液適當(dāng)稀釋過(guò)氧化氫酶液，將等量的過(guò)氧化氫酶稀釋液和8×10-3g/mL待測(cè)多肽溶液混勻，分別測(cè)定過(guò)氧化氫酶初始酶活力.后放入-20℃冰箱冷凍24h，取出25℃解凍，再放入-20℃冷凍3h，反復(fù)凍融3次后測(cè)過(guò)氧化氫酶酶活力.用過(guò)氧化氫酶殘余活力，即凍融后過(guò)氧化氫酶活力和凍融前酶活力比值表示抗凍活性，酶殘余活力越大，所測(cè)樣品抗凍活性越強(qiáng).

具體測(cè)定方法如下：往石英比色皿內(nèi)準(zhǔn)確加入蒸餾水1.9mL、加入待測(cè)酶液0.1mL和過(guò)氧化氫稀釋液1mL，蓋上比色皿蓋子，馬上搖勻，測(cè)定240nm初始吸光值，每隔1min記錄吸光值，計(jì)時(shí)5min.實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：以1min內(nèi)A240減少0.1酶量為1個(gè)酶活單位（μ）.

用過(guò)氧化氫酶殘余活力來(lái)表示抗凍活性大小.

2.2 酶解工藝的研究方法

2.2.1 五種不同蛋白酶對(duì)多肽抗凍活性的影響

研究選取五種蛋白酶：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶，據(jù)資料［9］知：酸性蛋白酶的最適pH為3，溫度為40℃；中性蛋白酶的最適pH為7，溫度為50℃；堿性蛋白酶的最適pH為8，溫度為40℃；復(fù)合蛋白酶的最適pH為7，溫度為40℃；木瓜蛋白酶的最適pH為7，溫度為50℃.各稱取5g明膠，加20mL蒸餾水，磁力恒溫水浴攪拌鍋預(yù)熱溶解，達(dá)到預(yù)設(shè)溫度后，酶和底物比例1∶30加入蛋白酶，以酶最適pH和溫度酶解，過(guò)程中用1mol/L鹽酸溶液或者1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH以維持酶最優(yōu)pH，酶解時(shí)間1h，后用沸水浴10min滅酶，收集酶解液，11600r/min離心10min，取上清液，-20℃預(yù)冷凍1d后，真空冷凍干燥2d，獲得抗凍多肽的固體粉末，裝入密封袋備用，檢測(cè)抗凍活性，操作如2.1所述.

另設(shè)計(jì)不同酶解時(shí)間進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，酶解時(shí)間分別為：0.5h、1h、2h、3h、4h，酶解操作和抗凍活性檢測(cè)同上述.

2.2.2 酶解工藝條件

每個(gè)樣品稱取5g魚皮明膠放入燒杯，加20mL蒸餾水，在磁力恒溫水浴鍋中預(yù)熱溶解，達(dá)到預(yù)設(shè)溫度后，加入篩選出的最適蛋白酶，反應(yīng)需在攪拌條件下進(jìn)行保證底物與酶充分接觸，在酶解過(guò)程中用1mol/L HCl溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，使酶解pH保持在預(yù)設(shè)數(shù)值.探討酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、酶和底物比例對(duì)抗凍多肽活性的影響，具體酶解條件設(shè)置如下：

（1）酶解溫度單因素試驗(yàn).固定酶解pH為3，時(shí)間為1h，底物比為1∶30，酶解溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃.

（2）酶解時(shí)間單因素試驗(yàn).固定酶解pH為3，溫度為40℃，底物比為1∶30，酶解時(shí)間分別為0.5h、1h、2h、3h、4h.

（3）酶解pH單因素試驗(yàn).固定酶解時(shí)間為1h，溫度為40℃，底物比為1∶30，酶解pH分別為2.5、3、3.5、4、4.5.

（4）酶和底物比例單因素試驗(yàn).固定酶解時(shí)間為1h，溫度為40℃，pH為3，酶和底物比例分別設(shè)置為1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90.

（5）酶解工藝條件的優(yōu)化.在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇各因素最優(yōu)條件為基準(zhǔn)，采用正交進(jìn)行優(yōu)化，其余酶解操作同2.2.1，抗凍活性檢測(cè)同2.1.

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解蛋白酶的篩選

本文選用五種蛋白酶：酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶酶解食品源魚皮明膠制備天然抗凍多肽，將制備的抗凍多肽添加進(jìn)入過(guò)氧化氫酶中進(jìn)行低溫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，-20℃冰箱冷凍24h后再反復(fù)凍融3次測(cè)定過(guò)氧化氫酶殘余活力，過(guò)氧化氫酶殘余活力越大表示樣品的抗凍活性越強(qiáng)，抗凍效果如圖1.

在控制各類蛋白酶的酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間、酶和底物比例等酶解條件下，酸性蛋白酶制備的天然抗凍多肽抗凍效果最佳，過(guò)氧化氫酶酶殘余活力為80.7%，堿性蛋白酶次之，復(fù)合蛋白酶效果最差.原因在于不同蛋白酶酶解位點(diǎn)不同，酶解產(chǎn)物不同，抗凍效果也就不一樣，即便是同一種蛋白酶在不同的酶解時(shí)間下的作用效果也不同.

圖1 五種蛋白酶制備抗凍多肽的活性比較

將五種在不同酶解時(shí)間0.5h、1h、2h、3h、4h制備的天然抗凍多肽的抗凍活性如圖2所示.由圖2看出，酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物的活性普遍比其他四種酶的保護(hù)活性高，其中酶解效果最好的是酸性蛋白酶在酶解時(shí)間1h時(shí)，過(guò)氧化氫酶酶殘余活力達(dá)到80.7%.原因可能是蛋白酶的酶切位點(diǎn)差異所引起的，魚皮明膠蛋白經(jīng)過(guò)酸性蛋白酶酶切后獲得了更多具有抗凍活性的多肽片段.另外抗凍活性表現(xiàn)次之的堿性蛋白酶在酶解0.5h和1h過(guò)氧化氫酶殘余酶活力基本在同一個(gè)水平上，酶解時(shí)間1h后抗凍效果隨酶解時(shí)間增長(zhǎng)而減弱，原因可能在于堿性蛋白酶將形成的抗凍多肽切割成更小片段而不具有活性.中性蛋白酶的最佳酶解時(shí)間為1h，超過(guò)1h抗凍效果開(kāi)始減弱.木瓜蛋白酶制備的天然抗凍多肽抗凍效果與酶解時(shí)間之間關(guān)系相對(duì)較弱，可能是因?yàn)槟竟系鞍酌该盖形稽c(diǎn)暴露的基團(tuán)整體不太利于發(fā)揮抗凍活性.

圖2 五種蛋白酶不同酶解時(shí)間制備的抗凍多肽的抗凍活性

3.2 酶解條件的影響

3.2.1 酶解溫度的影響

酶解溫度對(duì)制備的天然抗凍多肽的抗凍效果影響如圖3所示.抗凍活性在酶解溫度30～40℃隨酶解溫度上升而增強(qiáng)，但當(dāng)酶解溫度超過(guò)40℃之后，抗凍活性反而呈下降的趨勢(shì)，在40℃達(dá)到最高值，此時(shí)過(guò)氧化氫酶殘余活力為80.7%.分析原因可能在于，酶解溫度40℃時(shí)，酶解產(chǎn)生的具有抗凍活性的片段最多，而當(dāng)酶解溫度較低時(shí)會(huì)抑制酶的活性使酶解反應(yīng)沒(méi)辦法充分進(jìn)行，超過(guò)此范圍隨著溫度的升高，酶的活性降低甚至死亡.這也說(shuō)明抗凍效果的強(qiáng)弱關(guān)鍵在于酶解獲得的具有抗凍活性的多肽片段的多少，而與使用酶的活性大小并不存在必然的正相關(guān)關(guān)系.

圖3 酶解溫度對(duì)魚皮明膠酶解物的抗凍活性的影響

3.2.2 酶解時(shí)間的影響

酶解溫度對(duì)制備的天然抗凍多肽的抗凍效果影響如圖4.在測(cè)定范圍內(nèi)，抗凍活性隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)先升高后下降再升高，在酶解時(shí)間1h，過(guò)氧化氫酶殘余活力最高為80.7%.抗凍多肽的抗凍活性強(qiáng)弱取決于有效抗凍活性片段的多少，酶解時(shí)間1h時(shí)最高，此后隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，具有抗凍活性的片段可能又被酶解成沒(méi)有活性的片段，因此制備的抗凍多肽抗凍效果減弱.

圖4 酶解時(shí)間對(duì)魚皮明膠酶解物的抗凍活性的影響

3.2.3 酶解pH的影響

酶解pH對(duì)制備天然抗凍多肽的抗凍效果影響如圖5.隨著酶解pH值的增大，抗凍活性先增大后減小，在酶解pH為3.0時(shí)，制備的天然抗凍多肽抗凍效果達(dá)到最佳，過(guò)氧化氫酶殘余酶活力為80.7%，原因在于在過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境中可能抑制酶的活性，甚至可能致使酶死亡和活性喪失.此外與魚皮明膠等電點(diǎn)有關(guān)，據(jù)廠家信息提供所用魚皮明膠等電點(diǎn)在pH為4.5～6.5間，處于非等電點(diǎn)的魚皮明膠具有更好的溶解度，可與蛋白酶進(jìn)行更充分的接觸，可供酶切割位點(diǎn)的選擇更多，進(jìn)而可能獲得更多的抗凍多肽.

圖5 酶解pH值對(duì)魚皮明膠酶解物的抗凍活性的影響

3.2.4 酶和底物比例的影響

酶和底物比例對(duì)制備天然抗凍多肽的抗凍效果影響如圖6.在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，制備的天然抗凍多肽的抗凍效果隨著酶的添加量減少而減弱，在酶解底物比為1∶10效果最好，為82.9%.酶和底物比例在1∶30時(shí)，過(guò)氧化氫酶殘余活力為80.7%，與1∶10的抗凍效果相差不多，但相比加酶量少很多，考慮到經(jīng)濟(jì)成本的問(wèn)題，最終選取酶解底物比為1∶30進(jìn)行后續(xù)的酶解條件優(yōu)化.

圖6 酶解底物比對(duì)魚皮明膠制備抗凍多肽活性的影響

3.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件，并采用測(cè)定過(guò)氧化氫酶殘余活力來(lái)表示抗凍效果作為條件篩選指標(biāo).具體的因素水平表如表1所示.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

正交優(yōu)化結(jié)果如表2所示.結(jié)果顯示，酶解時(shí)間對(duì)制備的天然抗凍多肽的抗凍效果影響最大，酶解pH次之，再者是酶和底物比例，最后是酶解pH.酸性蛋白酶制備魚皮明膠抗凍多肽的最優(yōu)酶解工藝條件為A1B1C3D3組合，即酶解溫度35℃，酶解時(shí)間0.5h，酶解pH為3.5，底物比1∶40.在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到酶成本較高，可以適當(dāng)調(diào)整酶和底物比例，降低酶的使用量，減少成本，也可以根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)調(diào)整其他工藝條件以獲得最高經(jīng)濟(jì)效益.

表2 正交實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

以食品源魚皮明膠制備天然抗凍多肽，采用過(guò)氧化氫酶殘余活力測(cè)定抗凍活性，從復(fù)合蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中篩選出酸性蛋白酶效果最佳.以酸性蛋白酶酶解食品源魚皮明膠制備天然抗凍多肽，單因素試驗(yàn)中，酶解時(shí)間最佳為1h，酶解溫度最佳為40℃，酶和底物比例最佳為1∶30，酶解pH值最佳為3；正交優(yōu)化結(jié)果最優(yōu)酶解工藝條件：酶解溫度35℃，酶解時(shí)間0.5h，酶解pH為3.5，底物比1∶40.項(xiàng)目制備的抗凍多肽來(lái)源于食品源的魚皮明膠，天然安全且具有良好的抗凍效果，同時(shí)提升了魚皮下腳料的利用價(jià)值，具有顯著的商品開(kāi)發(fā)價(jià)值.

TS213.2

A

1008-7974（2018）01-0060-05

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2018.02.016

2017-10-17

福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT160839）.

1.洪燕婷，女，福建南安人，黎明職業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院教師；黃茂坤，薛雅茹，林志杰，黎明職業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院（福建 泉州 362000）.2.汪少蕓，福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院.

［1］汪少蕓，趙珺，吳金鴻，等.抗凍蛋白的研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（15）：7888-7890.

［2］X Ding，H Zhang，H Chen，et al.Extraction，puridication and identification of antifreeze proteins from cold acclimated malting barly （Hordeum vulgare L.）［J］.Food Chemistry，2015，175：74-81.

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王海波）