周 敏，許再元，蘇水嬌，彭密軍

(廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東 廣州 510070)

微孔板試劑盒法測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量

周 敏，許再元，蘇水嬌，彭密軍*

(廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東 廣州 510070)

基于植物乳桿菌(ATCC 8014)生長時的新陳代謝強(qiáng)度與生物素濃度的關(guān)系，定量測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量。將稀釋了的提取物和生物素檢測培養(yǎng)基加至包被有植物乳桿菌的微孔中，植物乳桿菌生長量與生物素濃度形成關(guān)系并可以繪制成多項(xiàng)式擬合曲線，根據(jù)培養(yǎng)后菌懸液的吸光度值與生物素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，計(jì)算出嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量。微孔板試劑盒法測定生物素的線性范圍為0.080～0.720 μg·100 g-1，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.998 9，測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)回收率為91.2%～99.3%。結(jié)果表明，微孔板試劑盒法具有快速、簡便、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性良好等優(yōu)點(diǎn)，是測定嬰幼兒配方奶粉中生物素的有效方法。

微孔板試劑盒法； 生物素；嬰幼兒配方奶粉； 植物乳桿菌

生物素(Biotin)又稱維生素H、輔酶R、維生素B7，是一種水溶性B族維生素。生物素是合成維生素C的必要物質(zhì)，是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機(jī)能健康必要的營養(yǎng)素，對脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝起到至關(guān)重要的作用，在脂肪合成、糖質(zhì)新生等生化反應(yīng)途徑中扮演重要角色。生物素主要來源于酵母、花椰菜、堅(jiān)果類、蛋黃、肝臟和腎臟。人體腸道細(xì)菌可合成一些生物素，人體極少缺乏。但研究表明，由于嬰兒腸道功能較弱，導(dǎo)致缺乏生物素而易患舌炎和皮炎，有可能造成嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)躁狂、嗜睡和發(fā)育遲緩，并可引起猝死綜合癥，因此生物素常作為一種營養(yǎng)補(bǔ)充劑而被廣泛添加到嬰幼兒食品中[1]。

有關(guān)文獻(xiàn)報道的常用于生物素的經(jīng)典檢測方法有微生物法[2-3]、分光光度法[4]、酶聯(lián)免疫法[5-6]、高效液相色譜法[7-9]和超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[10-11]。分光光度法靈敏度差，基質(zhì)干擾較大，只適用于基質(zhì)簡單，生物素含量高的樣品。酶聯(lián)免疫法干擾因素較多，重復(fù)性不好。高效液相色譜法對成分復(fù)雜、色素較多、雜質(zhì)干擾大的樣品分離效果不好。而超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法成本高，且操作起來費(fèi)時費(fèi)力，樣品前處理十分煩瑣。微生物法是最為靈敏和應(yīng)用最為廣泛的方法，主要用于生物素的微量檢測。本文采用德國拜發(fā)生物素試劑盒對嬰幼兒配方奶粉中的生物含量進(jìn)行檢測，利用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對生物素的靈敏性和特異性，定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。通過植物乳桿菌的生長量來測定嬰幼兒配方奶粉中生物素的含量，并從方法線性、精密度和回收率等方面研究該方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和可靠性。微孔板試劑盒法避免了大量玻璃器皿的使用，減少了對試驗(yàn)微生物生長帶來抑制或促進(jìn)的各類因子，顯著降低了外部因素的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德國拜發(fā)生物素試劑盒，包括1×96孔微孔板，包被有植物乳桿菌Lactobacillusplantarum，3×30 mL無菌蒸餾水(準(zhǔn)備培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取稀釋液)，3×生物素培養(yǎng)基(固體)，3×生物素標(biāo)準(zhǔn)品(固體)，3×粘合箔，1×微孔板框。生物素標(biāo)準(zhǔn)品(99.6%)國產(chǎn)，中國食品藥品檢定研究院。

生物安全柜，微孔板酶標(biāo)儀，生化培養(yǎng)箱，95 ℃水浴鍋，pH計(jì)，離心機(jī)，無菌離心管，無菌微量移液器，無菌注射器，0.2 μm無菌濾膜。

1.2 生物素儲備液的配制

生物素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(112.6 μg·mL-1)：稱取112.6 mg生物素標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。儲存于棕色瓶中，于2～4 ℃冰箱保存12個月。

生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.126 μg·mL-1)：準(zhǔn)確吸取1.00 mL生物素標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于100 mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶液稀釋并定容至刻度。混勻后儲存于瓶中，于2～4 ℃冰箱保存6個月。

1.3 樣品前處理

根據(jù)樣品中生物素的含量確定稀釋倍數(shù)，確保樣品提取液稀釋后落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。稱取1.0 g(精確至0.1 mg)至一個50 mL離心管中，加入約30 mL蒸餾水，搖勻，用HCl或NaOH調(diào)pH至8.0±0.2，搖勻，加蒸餾水至40 mL。95 ℃水浴30 min，其間振蕩至少5次，確保離心管緊閉，并迅速冷卻到30 ℃以下，并用0.2 μm無菌濾膜過濾至1.5 mL或2.0 mL無菌離心管中，并再對樣品濾液進(jìn)行稀釋備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的制備

將試劑盒中生物素標(biāo)準(zhǔn)品瓶簽上標(biāo)注的規(guī)定量無菌水(取自試劑盒)加入標(biāo)準(zhǔn)品瓶中，蓋上標(biāo)準(zhǔn)品瓶蓋，搖勻稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液。取18個2.0 mL無菌離心管，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.5 生物素培養(yǎng)基的配制

加入10 mL無菌水(取自試劑盒)至生物素培養(yǎng)基瓶中，蓋好培養(yǎng)基瓶，搖勻。95 ℃水浴加熱5 min，其間振蕩至少2次，并確保瓶子封閉，并迅速冷卻到30 ℃以下，并用0.2 μm無菌濾膜過濾至15 mL無菌離心管中。

1.6 加樣和培養(yǎng)

微孔板試劑盒法中必須使用無菌水稀釋的無菌樣品，無菌水取自試劑盒，取出需要數(shù)量的微孔板條并在板上固定，首先用無菌微量移液器移取150 μL生物素培養(yǎng)基至微孔中，然后移取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋的樣品至指定的微孔中，重復(fù)3次。最后，去除黏合箔上的保護(hù)層，將其平放在微孔條上，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。將微孔板至于37 ℃黑暗條件下孵育44～48 h。

1.7 生物素含量的測定及計(jì)算

培養(yǎng)結(jié)束后，再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，平面振蕩，使菌懸液均勻分布于微孔中，從微孔板右上角以對角線180°輕扯下粘合箔，與此同時另一只手按住放置在桌面上的微孔板，防止粘合箔與微孔板粘合過緊而在撕扯時帶起微孔板。用無菌移液管尖破壞微孔中液體表面的所有泡沫。在630 nm條件下，用酶標(biāo)儀讀取菌懸液的濁度。嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量計(jì)算公式：

X=C×K÷M。

其中X為生物素含量，μg·100 g-1；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度，μg·100 g-1；K為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

計(jì)算結(jié)果時使用拜發(fā)公司提供的配套RIDA? SOFT Win 軟件。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線空白的D值小于標(biāo)準(zhǔn)品1的D值，且標(biāo)準(zhǔn)品5的D值大于0.6時，判定檢測結(jié)果有效，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。測得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)為0.998 9。

圖1 生物素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的重復(fù)性試驗(yàn)

用微生物法對同一嬰幼兒配方奶粉測定了6次，生物素含量測定結(jié)果見表1。6次測定的平均值為28.96 μg·100 g-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，說明該方法的重復(fù)性良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表1 生物素重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果

2.3 方法的回收率試驗(yàn)

稱取已知生物素含量的嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行回收率試驗(yàn)，先對試驗(yàn)樣品進(jìn)行前處理，然后按表2精確地加入生物素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述的方法進(jìn)行培養(yǎng)后測定生物素的含量。由表2可見，該方法回收率為91.2%～99.3%，回收率穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高。

表2 生物素加標(biāo)回收試驗(yàn)的結(jié)果

3 小結(jié)

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，利用植物乳桿菌的生長測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量的微孔板試劑盒方法具有操作步驟簡單、檢測周期短、檢出限低、結(jié)果準(zhǔn)確與重現(xiàn)性高的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)國標(biāo)方法相比，避免了大量玻璃器皿的使用，節(jié)省了人力物力；采用包被了植物乳桿菌的微孔板省去了接種液制備的步驟，極大地降低了菌種在傳代、保存以及活化過程中發(fā)生突變、污染的可能性，菌株的活力更加穩(wěn)定，保證了整個實(shí)驗(yàn)的可靠性和有效性；D值的讀取時間一致，有利于減少系統(tǒng)誤差，提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。該方法測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量是有效可行的。

用微孔板試劑盒法測定生物素含量，有很多因素可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。因此，整個實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)人員都有較高的要求，采用本方法需要注意以下試驗(yàn)要點(diǎn)：首先是整個實(shí)驗(yàn)過程一定要注意無菌操作，避免污染。生物素檢測所用器皿均嚴(yán)格清洗干凈并消毒滅菌，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、樣品的過濾除菌都要在無菌環(huán)境進(jìn)行。其次，樣品前處理以及生物素培養(yǎng)基水浴后的降溫過程一定要迅速，避免產(chǎn)生有色物質(zhì)，對酶標(biāo)儀D值的讀取造成誤差，并且建議每個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品以及不同稀釋倍數(shù)的樣品做3個平行對照，取平均值。樣品稀釋后的生物素濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置，并且多選幾個稀釋度，注意稀釋液的均勻性以及微量稀釋過程的準(zhǔn)確性。再次，使用拜發(fā)公司提供的配套RIDA? SOFT Win 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于微生物的生長是非線性的，采用四參數(shù)擬合更符合實(shí)驗(yàn)用菌株的實(shí)際生長狀況，得出的樣品中的生物素含量的數(shù)據(jù)更加精確。最后，應(yīng)該保存每次試驗(yàn)樣品測定的所有數(shù)據(jù)和信息，為以后的測定提供參考，從而提高工作效率，并且每次試驗(yàn)條件盡可能保持一致，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效性和代表性以及試驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

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2017-09-26

廣東省科學(xué)院項(xiàng)目(2017GDASCX-0702)

周敏(1986—)，女，湖南長沙人，工程師，碩士，從事微生物檢測及研究工作，E-mail:zhoumin07079999@163.com。

彭密軍(1967—)，女，湖南湘潭人，教授，博士，從事天然產(chǎn)物的研發(fā)工作，E-mail:pengmj163@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式：周敏，許再元，蘇水嬌，等. 微孔板試劑盒法測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(12)：2246-2248.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171251

TS207.3

A

0528-9017(2017)12-2246-03

張 韻)