劉玉洋，盧江杰,2*，王慧中,2*，王志安，陳建鋼，閔 會

(1.杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省中藥材研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 4.寧波金瑞農業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 寧波 315300；5.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052)

浙麥冬主產區(qū)種質資源遺傳多樣性評價

劉玉洋1，盧江杰1,2*，王慧中1,2*，王志安2,3，陳建鋼4，閔 會5

(1.杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省中藥材研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 4.寧波金瑞農業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 寧波 315300；5.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052)

根據NCBI公共數據庫中的麥冬序列，開發(fā)了52對微衛(wèi)星分子標記，利用開發(fā)的分子標記對浙麥冬主產區(qū)現有種質資源進行遺傳多樣性研究。結果表明，浙麥冬各種質資源遺傳多樣性較低；聚類分析結果顯示慈溪的種質資源相對集中，表明其遺傳背景單一，不利于浙麥冬產業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。因此，迫切需要引進其他地區(qū)的優(yōu)良種質資源，以進行遺傳改良和新品種選育，從而保證浙麥冬產業(yè)的健康發(fā)展。

麥冬； 遺傳多樣性； SSR標記； 種質資源； 中藥材

麥冬[Ophiopogonjaponicus(Thunb) Ker-Gawl]又稱為麥門冬、沿階草、寸冬等，是百合科沿階草屬多年生植物，在《神農本草經》中列為上品藥材，塊根作為中藥使用，是一種常用滋陰中藥，對肺燥干咳、虛勞咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、腸燥便秘等具有很好的療效[1-4]。麥冬主產地在浙江、四川、湖北、福建省，主要品種包括浙麥冬、川麥冬、湖北麥冬、福建麥冬。其中以浙麥冬為最佳，是著名的“浙八味”之一。麥冬的主要活性成分，一般有甾體皂苷、高異黃酮類、多糖等[5-8]。浙麥冬2015年種植面積達262.2 hm2，衍生開發(fā)的參麥注射液、生脈膠囊等產品在2015年銷售額達20多億元。對近幾年文獻資料研究發(fā)現，有關麥冬的研究大多集中在其藥用成分、藥理作用方面[9-10]，種質資源以及遺傳多樣性方面研究較少[11-12]。

研究物種遺傳多樣性，對了解物種的起源、估算基因資源分布、確定核心種質并保存、預測種源適應性、進行種質資源開發(fā)與利用、進行雜交育種的親本選配等均具有非常重要的意義。分子標記技術在遺傳多樣性分析中發(fā)揮了重要作用[13]。簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)又稱微衛(wèi)星DNA，其核心序列為1～6個堿基的簡單串聯重復序列，廣泛存在于真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，具有等位基因數量多、數量豐富、遺傳共顯性、多態(tài)性高、重復性好、分析簡單等優(yōu)點[14-15]。目前該技術已廣泛應用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、目標基因定位以及指紋圖譜繪制等研究[16]。本研究主要對浙江省內不同地區(qū)的麥冬種質資源，利用SSR分子標記技術揭示其遺傳多樣性，為麥冬現有生產種質的識別和評價奠定理論基礎，為現有品種遺傳改良和優(yōu)良新品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年4—5月，于浙江省麥冬主產區(qū)和其他地區(qū)采挖浙麥冬、川麥冬和山麥冬種質資源20份(表1)。剪取新鮮葉片置于采樣箱，帶回實驗室后-20 ℃冰箱內保存，用于后續(xù)提取DNA。PCR儀(9700，ABI公司)；垂直電泳槽(JY-SCZF-A型，北京君意東方電泳設備有限公司)；臺式高速冷凍離心機(5424R，Eppendorf公司)；數控水浴鍋(SCG-4，寧波新芝生物科技股份有限公司)；電泳儀(PowerPac系列，Bio-Rad公司)。SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DNA Marker B、10×TaqBuffer、dNTPs和TaqDNA Polymerase均采購于杭州皓豐生物技術有限公司；丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、硝酸銀、氫氧化鈉和四硼酸鈉等化學試劑均采購于華東醫(yī)藥股份有限公司。

表1 供試麥冬種質資源來源

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

麥冬葉片中含有較多的多糖、酚等物質，DNA提取參考Doyle等[17]的CTAB法稍作調整，從單株嫩葉中抽提、純化每份材料總DNA。

1.2.2 麥冬SSR標記開發(fā)

以Ophiopogonjaponicas為關鍵詞，在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行檢索，把得到的麥冬序列以.fasta文件格式保存。利用單機版SSR分析程序MISA (MIcroSAtellite)進行SSR位點的統計和分析(MISA軟件的參數：二核苷酸重復次數≥6次，三核苷酸重復次數≥5次，四核苷酸重復次數≥4次，五核苷酸重復次數≥3次，六核苷酸重復次數≥3次)。所得序列經stackPACK v 2.2去冗余后，用軟件Primer Premier 3.0(PRIMIER Biosoft International，CA，USA)進行引物設計，主要參數為：引物長度18～25 bp，避免二級結構，CG含量40%～70%，退火溫度45.0～65.0 ℃，PCR產物長度100～300 bp。

1.2.3 PCR擴增

PCR總反應體系為20 μL，含有50 ng DNA、0.4 μmol·L-1引物對、60 μmol·L-1dNTPs、2 mmol·L-1MgCl2、1 μL 10×PCR緩沖液及0.5 UTaqDNA聚合酶。所有PCR反應在PCR儀(9700，ABI公司)中進行，反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，各引物退火溫度下復性30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

在30 mL的6%丙烯酰胺溶液中加入350 μL的10%過硫酸銨和25 μL的TEMED，混合均勻后水平灌膠，插上梳子，除氣泡后水平放置，至膠凝固(約30 min左右)。取5 μL擴增產物與1 μL 6×上樣緩沖液混合均勻后點樣。在1×TBE緩沖液中，200 V電泳1 h。電泳結束，用ddH2O將凝膠漂洗5 min后，放入500 mL 0.1%的AgNO3溶液中染色，搖床上搖動10 min，之后在ddH2O中漂洗10 s。將漂洗之后的凝膠放入含有400 mL氫氧化鈉溶液(6 g氫氧化鈉，0.076 g四硼酸鈉)和500 μL甲醛的顯影液中，搖床搖動直至凝膠上出現清晰的條帶。最后用ddH2O漂洗約2 min，取出凝膠。

1.2.5 數據分析

在BIO-RAD visadoc 3.0(Bio-RAD，USA)成像系統中掃描凝膠，使用Quantity One軟件依據DNA Marker計算出每個條帶的大小，然后依據SSR重復單元大小進行人工矯正，確定等位變異大小(bp)及數目，形成位點等位基因矩陣；由軟件PowerMarker version 3.25[18]進行豐富度(A)和多態(tài)信息含量(PIC)等多樣性指數計算。

2 結果與分析

2.1 麥冬SSR位點情況

在NCBI上共搜索到麥冬DNA序列545條，約462 kb。經生物信息學分析發(fā)現共有104個SSR位點：其中，兩堿基重復位點28個，以(AG)n最多，共24個；三堿基重復位點39個，以(AGC)n最多，共11個；四堿基重復位點6個；五堿基重復位點8個；六堿基重復位點23個。

2.2 麥冬SSR分子標記開發(fā)情況

從發(fā)現的104個SSR位點中，最終設計得到52個麥冬SSR標記。其中，包含兩堿基重復SSR位點的標記12個，三堿基重復SSR位點的標記29個，四堿基重復SSR位點的標記4個，五堿基重復SSR位點的標記1個，六堿基重復SSR位點的標記3個；另外，還有包含兩類重復SSR位點的標記3個，分別是兩堿基和三堿基復合位點的標記OJ-ESSR-9，三堿基和四堿基復合位點的標記OJ-ESSR-23，以及五堿基和六堿基復合位點的標記OJ-ESSR-16。52個麥冬SSR標記的PCR產物最小為101 bp，最大為291 bp；200 bp以內的17個，其余的35個均為200～300 bp。

電泳結果表明，本研究開發(fā)的52個麥冬SSR標記中，有28個可以在20個麥冬種質資源中得到清晰條帶，OJ-ESSR-4、OJ-ESSR-13、OJ-ESSR-36和OJ-ESSR-45可以得到1個條帶，其余的24個標記可得到2～7個條帶。這28對引物的詳細信息見表2。圖1是麥冬SSR標記OJ-ESSR-4和OJ-ESSR-38的電泳結果。

表2 28個多態(tài)性麥冬SSR標記信息

注：A，等位基因豐富度；PIC，多態(tài)信息含量。

A和B分別為麥冬SSR標記OJ-ESSR-38和OJ-ESSR-4；圖中數字1～20表示麥冬種質資源，與表1相同；M為DNA marker圖1 麥冬種質資源的微衛(wèi)星標記電泳結果

2.3 麥冬種質資源遺傳多樣性分析

基于24個多態(tài)性豐富的SSR標記，將20個麥冬種質資源聚類成3個類群：類群1，闊葉山麥冬(W1)和細葉山麥冬(W8)單獨聚類成一支，表明山麥冬和浙麥冬雖然形態(tài)上較為相似，但是他們具有明顯不同的遺傳背景，這與山麥冬屬于山麥冬屬，與浙麥冬為不同的屬的傳統分類結論一致；類群2，15個浙麥冬主產區(qū)種質中的11個和1個衢州種質(W6)聚類成另一個分支，表明目前浙江省生產上的麥冬種質資源遺傳背景相對單一，這也是由于浙麥冬長期無性繁殖造成的結果；類群3，磐安細葉(W3)、蕭山浙麥冬(W7)和另外2個浙麥冬(W19和W20)以及2個川麥冬(W4和W5)聚類成第三個分支，可見浙江省麥冬主產區(qū)仍有如天元鎮(zhèn)和二塘村那樣遺傳背景獨特的種質，這有利于浙江省麥冬種質資源的遺傳改良(圖2)。

W1～W20分別表示本研究中使用的麥冬種質資源材料，與表1相同圖2 基于SSR標記的麥冬種質資源遺傳聚類情況

3 小結與討論

本研究發(fā)現，主產區(qū)寧波慈溪的浙麥冬相對其他地方的麥冬種質資源，遺傳背景較為單一。這可能會給當地浙麥冬的生產帶來潛在的風險，而且對于麥冬產業(yè)的升級也是瓶頸。因此，為了保證浙江省麥冬產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，迫切需要引進其他地區(qū)的優(yōu)良種質資源，或者更好地利用現有的如天元鎮(zhèn)和二塘村的特異種質，進行遺傳改良和新品種選育。其次，浙麥冬和川麥冬雖然有效成分組成和含量差異明顯，但在遺傳上仍具有一定的相似性，這為道地藥材的分子鑒定帶來了一定的難度，當然具體到浙麥冬和川麥冬有效成分含量的差異是否完全由遺傳背景引起還有待進一步研究。第三，本研究開發(fā)的SSR標記可以準確區(qū)分山麥冬和浙麥冬，這些標記可以用于浙麥冬藥材的分子鑒定，打擊以次充好，從而規(guī)范藥材市場。

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2017-11-01

浙江省教育廳一般科研項目(Y201533071)；杭州市種子種苗專項(20150932H02)；浙江省農業(yè)(中藥材)新品種選育重大科技專項(2016C02058)

劉玉洋(1991—)，男，山東日照人，碩士研究生，研究方向為藥用植物分子生物學，E-mail: yuyang19911026@sina.cn。

盧江杰(1982—)，男，浙江杭州人，講師，博士，主要從事藥用植物分子生物學研究工作，E-mail: lujj@hznu.edu.cn；王慧中(1962—)，男，浙江義烏人，教授，博士，主要從事中藥資源和開發(fā)研究工作，E-mail: whz62@163.com。

文獻著錄格式：劉玉洋，盧江杰，王慧中，等. 浙麥冬主產區(qū)種質資源遺傳多樣性評價[J].浙江農業(yè)科學，2017，58(12)：2146-2149.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171220

S567.23+2

A

0528-9017(2017)12-2146-04

侯春曉)