連世忠 馮靖苗旺 郭庚 王宏勤 胡曉玲 宋彬 徐勇明 徐茗黃訓(xùn) 師如意

青蒿琥酯調(diào)節(jié)Claudin-5基因表達影響膠質(zhì)瘤細胞力學(xué)特性的研究

連世忠1馮靖1苗旺1郭庚1王宏勤1胡曉玲2宋彬3徐勇明1徐茗4黃訓(xùn)5師如意2

目的檢測青蒿琥酯(Art)對膠質(zhì)瘤SHG44細胞中Claudin-5基因表達及細胞力學(xué)特性的影響。方法利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、原子力顯微鏡檢測法、trans-well法分別檢測Art對Claudin-5基因表達、SHG44細胞力學(xué)特性及細胞遷移能力等方面的影響。結(jié)果Art可顯著上調(diào)細胞間緊密連接蛋白Claudin-5基因表達；同時可以明顯改變SHG44細胞力學(xué)特性：30 mg/l Art處理后的細胞粘附力顯著升高（2600±400） pN vs （3800±300） pN，細胞彈力顯著下降（26±6） MPa vs（4.7±1.6)MPa，細胞表面粗糙度大幅上升（0.150±0.013） μm vs（0.330±0.022） μm，可有效抑制SHG44細胞的遷移。結(jié)論實驗結(jié)果表明Art可以通過影響Claudin-5基因表達，從而改變SHG44細胞力學(xué)特性進而發(fā)揮其抗癌作用，是潛在的膠質(zhì)瘤治療新藥。

青蒿琥酯； 膠質(zhì)瘤； Claudin-5基因； 細胞力學(xué)特性

膠質(zhì)瘤是人類神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。隨著人們生活方式的大幅改變，尤其是家電和通訊業(yè)的蓬勃發(fā)展，人們越來越多地受到來自各種通訊器材和電器的輻射，膠質(zhì)瘤發(fā)病率及死亡率亦隨之升高，如何降低發(fā)病率、提高患者治療效果成為目前的研究重點[1]。因此，本文以人膠質(zhì)瘤細胞SHG44為研究對象，通過對比青蒿琥酯（Artesunate，Art）處理前后SHG44細胞中Claudin-5基因表達變化情況、細胞力學(xué)變化情況以及細胞遷移能力變化情況，觀察Art對細胞力學(xué)特性及遷移能力的影響，以期為Art作為潛在的抗膠質(zhì)瘤新藥提供有效的科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

人膠質(zhì)瘤SHG44細胞株（中科院上海生化與細胞生物所）；青蒿琥酯注射用滅菌粉末（廣西桂林制藥廠）；DMEM培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶 （Gibco公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；PCR 儀（BD 公司，美國）；Agilent 5500 型原子力顯微鏡（Agilent公司，美國）。

二、細胞培養(yǎng)及藥物處理

將人膠質(zhì)瘤SHG44細胞株常規(guī)培養(yǎng)于37℃的CO2培養(yǎng)箱中至細胞貼壁。培養(yǎng)條件：細胞接種于DMEM培養(yǎng)基中 (含10%胎牛血清)；5%CO2+95%空氣，100%濕度。每24 h換液1次，當(dāng)細胞生長匯合時，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)進行消化，按1∶2傳代，細胞擴增后備用。

課題組前期細胞增殖實驗結(jié)果提示，30 mg/l Art可以作為較為合適的用藥濃度有效抑制SHG44的增殖[1]。因此，后續(xù)其他實驗將30 mg/l Art作為有效藥物濃度進行使用。

將6孔細胞培養(yǎng)板中放入滅菌的蓋玻片，之后取對數(shù)生長期SHG44細胞，調(diào)整細胞濃度為4×105個/孔，接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁之后，培養(yǎng)結(jié)束為對照組細胞，實驗組細胞則需在培養(yǎng)基中加入30 mg/l Art繼續(xù)對細胞進行處理24 h。

三、Claudin-5基因在Art處理前后表達情況

按照TAKARA PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]使用說明進行操作，分別提取對照組和30 mg/l Art實驗組的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進行25 μl體系的PCR 反應(yīng)（buffer 5 μl，dNTP 2 μl，GaPDH 與Claudin-5兩對上下游引物各 0.4 μl，酶 0.5 μl，其余由滅菌雙蒸水補足 25 μl）；GaPDH 反應(yīng)程序如下：98℃，3 min預(yù)變性，98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，33 次 循環(huán)，72℃，8 min總延伸；Claudin-5反應(yīng)程序如下：98℃，3 min 預(yù)變性，98℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min，35次循環(huán)，72℃，8 min總延伸。內(nèi)參基因GaPDH與Claudin-5基因引物序列見表1。

表1 GaPDH與Claudin-5基因引物序列表

四、原子力顯微鏡樣品制備

將鋪有對照組和30 mg/l Art實驗組細胞的蓋玻片分別用三蒸水緩慢沖洗，用1%戊二醛溶液固定15 min，再用蒸餾水小心沖洗3次，室溫自然干燥后上機觀察。

五、樣品成像和粘彈性探測

將制備好的樣品置于Agilent5500原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）載物臺上，利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞的分散情況，在大氣中應(yīng)用AFM對樣品進行掃描成像，在液相中應(yīng)用AFM力譜對樣品進行粘彈性探測。成像時，在操作軟件中選擇tapping模式，氮化硅型探針，微懸臂彈性系數(shù)為0.68 N/m，力譜探測時選用彈性系數(shù)為0.10 N/m的探針。AFM圖像經(jīng)過軟件（Picoimage1.6和Gywddion2.26）平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。對照組與30 mg/l Art實驗組分別重復(fù)5次。

六、細胞遷移實驗

取對照組和30 mg/l Art實驗組細胞，在transwell上室中加入無血清DMEM培養(yǎng)基，每個transwell上室中接種 1×104個 SHG44細胞。Trans-well下室中，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后，結(jié)晶紫染色浸潤細胞，顯微鏡下選取不同視野計數(shù)。實驗重復(fù)5次。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，2組結(jié)果之間比較采用t檢驗，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Art對膠質(zhì)瘤SHG44細胞中Claudin-5基因表達及細胞力學(xué)特性的影響

PCR檢測結(jié)果表明，Art處理過的SHG44細胞其細胞間的緊密連接蛋白Claudin-5的表達量顯著高于對照組（圖1）；相較于對照組，實驗組細胞間連接程度明顯加大，細胞的粘附力顯著升高 [（2600±400） pNvs （3800±300） pN；t=6.7×10-4，P＜0.05]，細胞彈力顯著下降[（26±6） MPavs（4.7±1.6） MPa；t=6.41×10-6，P＜0.05]， 細胞表面粗糙度大幅上升 [（0.15±0.013） μmvs（0.33±0.022）μm；t=2.87×10-7，P＜0.05]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖2～3。

圖1 青蒿琥酯處理前后SHG44細胞中Claudin-5表達情況

二、Art對膠質(zhì)瘤SHG44細胞遷移能力的影響

Trans-well實驗結(jié)果提示，Art處理過的SHG44細胞其細胞遷移能力受到了抑制，顯著低于對照組細胞[（26±2.45） vs （59±5.92）；t=2.92×10-6，P＜0.05]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

討 論

膠質(zhì)瘤是人類神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，給社會和患者家庭均造成了沉重的負擔(dān)，開發(fā)高效、低毒、廉價的抗膠質(zhì)瘤新藥成為目前研究熱點。中藥Art是青蒿素的一種衍生物，是一個包含過氧化物基（-C-O-O-C-）的倍半萜框架復(fù)合物[3]。起初，Art主要被用作治療瘧疾，之后有研究表明Art可通過阻滯細胞周期、抑制腫瘤新生血管形成、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達等作用機制而實現(xiàn)抑癌作用[4-6]。因此，本研究以膠質(zhì)瘤細胞系SHG44為研究對象，觀察Art對膠質(zhì)瘤細胞力學(xué)特性及細胞遷移能力的影響。

實驗結(jié)果提示，經(jīng)過Art處理的膠質(zhì)瘤細胞其細胞間緊密連接蛋白Claudin-5表達大幅上調(diào)。Claudin家族是細胞間形成緊密連接過程中必不可少的蛋白組成成分。有研究表明，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等不同癌癥中，Claudin家族成員無法正常表達，其功能受到抑制，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生[7-11]。Claudin-5是Claudin家族中重要的成員之一，也是血腦屏障的主要組成成分，當(dāng)其表達下調(diào)時，與腦膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生、患者血腦屏障功能減退有很大關(guān)系[12-14]。

圖2 原子力顯微鏡檢測青蒿琥酯處理前后SHG44細胞力學(xué)特性及細胞微觀結(jié)構(gòu)變化情況

圖3 原子力顯微鏡檢測青蒿琥酯處理前后SHG44細胞力學(xué)特性變化情況

圖4 青蒿琥酯處理前后SHG44細胞遷移情況

當(dāng)Art處理SHG44細胞后，Claudin-5表達顯著上調(diào)，表明膠質(zhì)瘤細胞之間的緊密連接程度升高，其潛在的遷移能力受到抑制，這與trans-well實驗結(jié)果相互印證。通過AFM檢測發(fā)現(xiàn)Art處理之后的單個SHG44細胞粘附力亦升高，導(dǎo)致其遷移能力大大降低，這與trans-well實驗結(jié)果同樣可以相互印證；實驗組膠質(zhì)瘤細胞的彈力經(jīng)AFM檢測發(fā)現(xiàn)呈顯著性下降。細胞彈力是反映細胞變形能力的一個重要指標(biāo)，其本質(zhì)上所反映的是細胞膜的力學(xué)特性及細胞骨架的狀態(tài)，彈力越大變形能力越高[15]。腫瘤細胞需要進行細胞變形才能完成侵襲、遷移等一系列生物學(xué)行為，彈力下降表明Art對SHG44的變形潛力起到了抑制作用[16]。

綜上所述，筆者推測Art可能通過上調(diào)Claudin-5的表達，使得膠質(zhì)瘤細胞間連接變緊密，并且影響膠質(zhì)瘤細胞表面的生物大分子的結(jié)構(gòu)，使得細胞表面粘附性增強，粗糙度大幅上升；同時，Art誘使SHG44細胞骨架變形，降低其細胞彈力，最終導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細胞變形能力下降，遷移受阻。本研究結(jié)果可從細胞力學(xué)新的方面為研究Art可能作為潛在的有效抑制膠質(zhì)瘤的藥物提供科學(xué)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

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Effects of Artesunate on gene Claudin-5 expression which could influent cell mechanical properties in Glioma

Lian Shizhong1,Feng Jing1,Miao Wang1,Guo Geng1,Wang Hongqin1,Hu Xiaoling2,Song Bin3,Xu Yongming1,Xu Ming4,Huang Xun5,Shi Ruyi2.1Department of Neurosurgery,First Hospital of Shanxi medical University,Taiyuan 030001,China;2Basic Medical School,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;3Department of Oncology,First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;4First Clinical Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;5Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Ji’nan University,Guangzhou 510630,China

Shi Ruyi,Email:tomruyi@163.com

Objective To observe the effects of Artesunate(Art)on expression of gene Claudin-5 in Glioma and cell mechaniacal properties by different biological detecting methods. Methods After treated by Art,the expression of gene Claudin-5 in SHG44 had been detected by polymerase chain reaction method;cell migration had been detected by trans-well method.And we used atomic force microscope to observe the change of cell mechanical properties. Results The Art could upregulate the expression of gene Claudin-5,which is the intercellular tight junction protein,leading to change of the mechanical properties of SHG44 cells to inhibit SHG44 cell migration effectively.The cell adhesive force increased significantly after 30 mg/l Art treatment(2600±400)pN vs(3800±300)pN.And the cell elasticity decreased significantly after 30 mg/l Art treatment(26±6)MPa vs(4.7±1.6)MPa.The membrane surface roughness of SHG44 increased significantly(0.15±0.013)μm vs(0.33±0.022)μm after 30 mg/l Art treatment. Conclusion The Art,which could be a potential anti-tumor drug,could affect the biological characteristics of SHG44 through regulating the expression of gene Claudin-5 to resist Glioma.

Artesunate;Glioma;Gene Claudin-5;Cell mechanical properties.

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.06.009

山西省基礎(chǔ)研究計劃（2015011095）

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科1；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤科3；030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院4；510630 廣州，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科5

師如意，Email：tomruyi@163.com

2017-02-27）

張麗）

連世忠,馮靖,苗旺,等.青蒿琥酯調(diào)節(jié)Claudin-5基因表達影響膠質(zhì)瘤細胞力學(xué)特性的研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(6):360-364.