曹端榮，龔靜青，金 玲，王乙婷

（深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518101）

瘦素及血管內(nèi)皮生長因子在復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中的表達(dá)與意義

曹端榮，龔靜青，金 玲，王乙婷

（深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518101）

目的 研究瘦素（Lp）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中的表達(dá)及意義。方法 選取2016年1月至2017年1月在深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)確診為翼狀胬肉的患者62例作為研究對象，其中原發(fā)性翼狀胬肉患者39例，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者23例。收集手術(shù)切除的翼狀胬肉進(jìn)行石蠟切片，行HE染色和VEGF、Lp、瘦素受體（LpR）染色，觀察原發(fā)性與復(fù)發(fā)性翼狀胬肉HE染色的不同及VEGF、Lp和LpR的表達(dá)情況。結(jié)果 與原發(fā)性翼狀胬肉相比，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉的組織切片上皮細(xì)胞數(shù)目增多，且成熟度增加，排列更加雜亂；上皮組織出現(xiàn)更嚴(yán)重的成纖維細(xì)胞增殖；基底細(xì)胞邊界更加模糊，且間質(zhì)中新生血管數(shù)目顯著增加。與原發(fā)性翼狀胬肉相比，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者的上皮層和基質(zhì)層Lp、VEGF的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），但LpR的表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 復(fù)發(fā)性翼狀胬肉組織中Lp和VEGF含量顯著增加，但LpR的表達(dá)無顯著變化，表明Lp和VEGF與翼狀胬肉復(fù)發(fā)存在一定關(guān)系。

瘦素；血管內(nèi)皮生長因子；翼狀胬肉

翼狀胬肉是眼科常見的眼表疾病之一，表現(xiàn)為局部球結(jié)膜纖維血管組織呈三角形增生，向角膜中央生長，可引起角膜散光而致視力下降，嚴(yán)重者會影響眼球運動。翼狀胬肉的治療方式以手術(shù)為主，但復(fù)發(fā)率較高，單純翼狀胬肉切除后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～50%[1]。目前，對于翼狀胬肉的復(fù)發(fā)機(jī)制尚無系統(tǒng)的理論研究，主要觀點認(rèn)為由于手術(shù)創(chuàng)傷、術(shù)后反應(yīng)等使殘留的翼狀胬肉組織中成纖維細(xì)胞和血管細(xì)胞活化，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，導(dǎo)致纖維血管組織形成。角膜表面及結(jié)膜下翼狀胬肉組織殘留是翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)，而鞏膜表面的新生血管進(jìn)入角膜創(chuàng)面是翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)的根本原因[2]。瘦素（leptin，LP）是一種脂源性內(nèi)分泌多肽類激素，有報道稱瘦素可以通過內(nèi)源性血管增生刺激因子間接促進(jìn)血管生成，起中間作用的內(nèi)源性因子有血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，血管通透性增高能使血漿蛋白滲出到細(xì)胞外基質(zhì)，有利于成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等在其中生長[3]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）具有很強的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生的能力。兩種物質(zhì)均能夠促進(jìn)術(shù)后鞏膜表面血管新生，促使翼狀胬肉復(fù)發(fā)[4]。本研究旨在分析原發(fā)性翼狀胬肉和復(fù)發(fā)性翼狀胬肉組織中的VEGF和Lp及其受體（LpR）的表達(dá)情況，并探討原發(fā)性和復(fù)發(fā)性翼狀胬肉臨床病理特征的差異，從而為預(yù)防翼狀胬肉復(fù)發(fā)提供新思路，為臨床預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性翼狀胬肉提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2016年1月至2017年1月在深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)確診為翼狀胬肉的患者62例作為研究對象，其中原發(fā)性翼狀胬肉患者39例，男18例，女21例，年齡38～80歲，平均（63.84±7.29）歲；復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者23例，男10例，女13例，年齡40～79歲，平均（68.41±6.81）歲。所有患者翼狀胬肉發(fā)生部位均位于鼻側(cè)球結(jié)膜區(qū)，并入侵角膜內(nèi)2 mm以上。比較兩組患者性別、年齡及翼狀胬肉發(fā)生部位，無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者的翼狀胬肉均長于鼻側(cè)球結(jié)膜區(qū)，生長方向指向角膜，并入侵角膜達(dá)2 mm以上；（2）未合并其他眼科疾病，無眼部外傷；（3）未使用其他藥物治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）長期使用滴眼液的患者；（2）進(jìn)行過其他眼部手術(shù)的患者；（3）精神疾病患者。

1.3 實驗方法

所有患者行翼狀胬肉切除術(shù)，收集手術(shù)中切除的翼狀胬肉。（1）取一部分于中性福爾馬林液中固定，進(jìn)行石蠟切片，制作的切片一部分用于HE染色，并在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)的觀察。（2）一部分石蠟切片用于VEGF、Lp和LpR染色。具體步驟：進(jìn)行烤片、脫蠟、水化、洗滌、封閉及抗原修復(fù)等，其中，洗滌用PBS，封閉用雙氧水，抗原修復(fù)用枸櫞酸緩沖液。完成上述步驟后用山羊血清封閉20 min，并孵育VEGF的一抗于4℃過夜，然后進(jìn)行二抗孵育，三抗孵育DAB顯色，于倒置熒光顯微鏡下觀察VEGF、Lp和LpR的表達(dá)情況。

1.4 閱片方法

由同一位病理科醫(yī)生在未告知其臨床資料的前提下使用光學(xué)顯微鏡閱片。免疫組化染色后，在10×40高倍鏡視野下，Lp及其受體和VEGF表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，呈彌漫性分布。陽性細(xì)胞染色從淺黃色至棕褐色。對組織上皮細(xì)胞和基質(zhì)層的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行評估。上皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）著色強度：0分為陰性，1分為弱陽性，2分為中等陽性，3分為強陽性；（2）陽性細(xì)胞率：0分為0%，1分為1%～25%，2分為26%～50%，3分為＞50%。以兩組數(shù)值的和評估上皮細(xì)胞Lp、LpR蛋白表達(dá)水平，而對組織基質(zhì)層和內(nèi)皮細(xì)胞的評估，則采用半定量的方法：0代表無表達(dá)，（+）代表局部表達(dá)，（++）代表彌散表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對本研究所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料采用（s）表示，運用 t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，運用卡方（χ2）檢驗，P＜0.05時，差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)發(fā)性翼狀胬肉與原發(fā)性翼狀胬肉的病理檢查結(jié)果比較

通過觀察HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性翼狀胬肉相比，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉的組織切片上皮細(xì)胞數(shù)目增多，且成熟度增加，排列更加雜亂；上皮組織出現(xiàn)更嚴(yán)重的成纖維細(xì)胞增殖；基底細(xì)胞邊界更加模糊，且間質(zhì)中新生血管數(shù)目顯著增加。

2.2 兩組患者上皮層Lp、LpR及VEGF表達(dá)情況比較

與原發(fā)性翼狀胬肉患者相比，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者的上皮層Lp和VEGF表達(dá)增加，兩組間差異存在顯著性（P＜0.05），但LpR的表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者上皮層Lp、LpR及VEGF表達(dá)情況比較（s，分）

表1 兩組患者上皮層Lp、LpR及VEGF表達(dá)情況比較（s，分）

組別 Lp 4.09±1.08 4.67±1.13 2.008 0.049原發(fā)組（n=39）復(fù)發(fā)組（n=23）t值P值LpR 4.81±1.07 5.03±1.24 0.737 0.464 VEGF 3.98±1.03 4.52±0.97 2.037 0.046

2.3 兩組患者基質(zhì)層Lp、LpR及VEGF表達(dá)情況比較

與原發(fā)性翼狀胬肉患者相比，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉患者的基質(zhì)層Lp和VEGF表達(dá)顯著增強（P＜0.05），但LpR的表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05），見表 2。

表2 兩組患者基質(zhì)層Lp、LpR及VEGF表達(dá)情況比較[n（%）]

3 討論

翼狀胬肉是眼科常見病和多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制還無統(tǒng)一定論，一般認(rèn)為是由于外界刺激導(dǎo)致局部球結(jié)膜纖維血管組織發(fā)生炎性病變所致，呈三角形生長，翼狀胬肉組織生長加速，血管顯著擴(kuò)張，侵犯角膜，嚴(yán)重影響視力。手術(shù)切除是治療翼狀胬肉的主要方法，但存在易復(fù)發(fā)的弊端，因此探究其發(fā)病機(jī)制及相關(guān)因素所起的作用至關(guān)重要[5]。本研究著重探究Lp及其受體和VEGF在翼狀胬肉復(fù)發(fā)中的作用。

瘦素是一種脂源性內(nèi)分泌多肽類激素，由肥胖基因編碼，主要由白色脂肪組織分泌，也可以由骨骼肌、胃黏膜、骨和軟骨等組織分泌。Lp在血液中呈游離狀態(tài)，與瘦素結(jié)合蛋白結(jié)合后，到達(dá)中樞和外周，與特異性瘦素受體（LpR）結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，也可在組織局部以自分泌和旁分泌的形式發(fā)揮作用。Sierra等發(fā)現(xiàn)Lp可誘導(dǎo)角膜新生血管生成，且在角膜感染模型中，呈較高的表達(dá)狀態(tài)[6]。也有報道稱瘦素受體也存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，瘦素可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的瘦素受體使其磷酸化而激活信號轉(zhuǎn)錄因子STAT3，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促使血管生成[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉的上皮層和基質(zhì)層中Lp表達(dá)顯著增加，而LpR表達(dá)與原發(fā)性翼狀胬肉不存在顯著性差異，表明Lp的表達(dá)與翼狀胬肉復(fù)發(fā)存在一定聯(lián)系。

VEGF是一種具有高度生物活性功能的糖蛋白，有很強的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，增強毛細(xì)血管通透性的能力。有研究表明，在翼狀胬肉的上皮細(xì)胞和纖維血管組織中均檢測到VEGF免疫強熒光，而正常結(jié)膜上皮VEGF免疫熒光弱表達(dá)[8]。更重要的是，Lp可以促進(jìn)VEGF表達(dá)，并與VEGF發(fā)揮協(xié)同誘導(dǎo)新生血管生成的作用，提示我們在翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程中，Lp和VEGF可能具有協(xié)同作用。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉的上皮層和基質(zhì)層中VEGF表達(dá)顯著增強，但對VEGF與Lp之間的相互作用，本研究并未進(jìn)行深入探討，希望在今后的研究中有新的發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉組織中Lp和VEGF含量顯著增加，但LpR的表達(dá)無顯著變化，表明Lp和VEGF與翼狀胬肉復(fù)發(fā)存在一定關(guān)系。

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R777．33

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1671-1246（2018）01-0151-02

深圳市寶安區(qū)科技計劃社會公益項目（醫(yī)療衛(wèi)生類）“Lp及VEGF在復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中的表達(dá)及意義”（2015005）