張園園 方肇勤

上海中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (上海， 201203)

PGK1基因沉默對SMMC7721肝癌細胞增殖的影響*

張園園 方肇勤△

上海中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (上海， 201203)

目的：觀察PGK1基因沉默對SMMC7721肝癌細胞增殖的影響。方法常規(guī)體外培養(yǎng)SMMC7721肝癌細胞，Lipofectamine 3000方法將shRNA-PGK1 質(zhì)粒及陰性載體轉(zhuǎn)染至SMMC7721細胞；熒光實時定量 PCR及 Western Blot 檢測 PGK1 的表達，MTT 檢測細胞相對存活率。結(jié)果與正常SMMC 7721 細胞相比，在PGK1沉默的肝癌細胞中，PGK1基因的表達降低，細胞的相對存活率減少。結(jié)論PGK1基因沉默能夠抑制SMMC7721肝癌細胞的增殖。

肝癌細胞；PGK1；RNA干擾；細胞增殖

原發(fā)性肝癌(肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤死亡率中居第二位[1]，嚴重危害人民生命健康。一直以來，中醫(yī)藥都是我國肝癌防治的重要力量，中醫(yī)藥在減輕患者臨床癥狀，配合放化療減毒增效，保護肝臟，預(yù)防腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，延長患者生存期等方面具有獨特的優(yōu)勢。然而，中醫(yī)藥防治肝癌的研發(fā)基礎(chǔ)相對薄弱，相關(guān)作用機制并不十分清楚。

近年來，本項目組在國家自然基金的連續(xù)資助下，經(jīng)過長期的研究和探索發(fā)現(xiàn)，預(yù)知子在體外能夠顯著抑制SMMC7721肝癌細胞的惡性增殖，與細胞毒抗生素G418聯(lián)用，具有減量增效的作用[2，3]；基因芯片檢測結(jié)果顯示，預(yù)知子的乙醇提取物能夠有效減少肝癌細胞中包括PGK1在內(nèi)的多種基因的表達，其與G418聯(lián)用，下調(diào)PGK1表達的作用增強；qRTPCR結(jié)果也進一步證實了這一結(jié)果。由此，我們推測：預(yù)知子可能是通過下調(diào)PGK1的表達，減少肝癌細胞SMMC7721的惡性增殖。然而，國內(nèi)外并無PGK1對SMMC7721肝癌細胞惡性增殖影響的相關(guān)報道。因此，我們計劃將含PGK1 RNAi片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SMMC7721細胞，使PGK1表達后沉默，觀察肝癌細胞的惡性增殖情況，以揭示兩者關(guān)系，為進一步探討預(yù)知子乙醇提取物防治肝癌的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、垂直式無菌無塵操作臺(中國造鑫企業(yè)有限公司)、Step One 定量 PCR 儀(美國 ABI 公司)， 酶標(biāo)儀(美國 Bio-TEX 公司)，Nanodrop 分光光度計(美國 Thermo 公司)，WB系統(tǒng)(美國BTO-RAD公司)。

1.1.2 主要實驗試劑 Psilencer2.1-U6 neo載體質(zhì)粒(美國Thermo 公司)、質(zhì)粒雙酶切試劑盒(美國NEB公司)，感受態(tài)細胞 DH5α、凝膠DNA回收試劑盒(天根生物科技有限公司)，TRizol、質(zhì)粒提取試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 (美國 Invitrogen 公司)，MTT、 DMSO(美國sigma公司)，1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗(美國 Gibco 公司)，鼠抗人 PGK1單克隆抗體、鼠抗人GAPDH 單克隆抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠 Ig G 抗體、鼠抗人GAPDH 單克隆抗體(美國Abnova公司 )，氯仿、異丙醇(上海國藥集團)，RT試劑盒、PCR 擴增試劑盒(日本 TaKaRa 公司)，RIPA裂解液(中)(碧云天公司)，PVDF膜(美國 Millipore 公司)。

1.1.3 細胞株 SMMC7721人肝癌細胞株為本實驗室凍存的細胞，購自中科院上海細胞所。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)細胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)參照文獻[4]進行。

1.2.2 PGK1干擾序列及引物序列的設(shè)計與合成 根據(jù)PGK1基因序列(NM_000291.3)，采用美國Life公司在線軟件設(shè)計sh RNA序列，采用在線軟件設(shè)計引物序列，均交由美國Invitrogen公司合成，shRNA序列：5’-GCTCAACAACATGGAGATTGG-3’。陰性質(zhì)粒由試劑盒提供。

采用Primer3(v.0.4.0)在線軟件設(shè)計PCR引物，PGK1-F：5’-TCACTCGGGCTAAGCAGATT-3’；PGK1-R：5’-CAGTGCTCACATGGCTGACT-3’。內(nèi)參以GAPDH為參照(GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；GAPDH-R：5’-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’)。

1.2.3 干擾質(zhì)粒的重組與擴增 使用限制性內(nèi)切酶(位點為BamHI、Hind III)切開質(zhì)粒，經(jīng)電泳鑒定酶切成功后，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將質(zhì)?；厥?。使用T4噬菌體DNA連接酶將質(zhì)粒與shRNA-PGK1連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α。在含50μg/ml 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板涂板，37℃過夜后挑選單克隆菌落，接種至含同樣濃度氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，振蕩過夜。次日，將少量菌液交由Invitrogen公司測序，余下菌液與等體積50%的消毒甘油(甘油加水稀釋高壓消毒)混勻后，放置-80℃冰箱保存。

收到公司測序結(jié)果后，與設(shè)計的shRNA-PGK1序列進行比對，確定一致后，使用Invitrogen公司的質(zhì)粒中抽試劑盒，抽提重組質(zhì)粒，Nanodrop檢測質(zhì)粒濃度，稀釋至100ng/ul，放置-20℃冰箱保存。

1.2.4 實時熒光定量 PCR(q RT-PCR)檢測 實驗分成 4組：未轉(zhuǎn)染的空白對照組(正常組)、G418對照組(G418組)、轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組(陰性組)和轉(zhuǎn)染PGK1重組質(zhì)粒的實驗組(PGK1RNAi組)。待細胞處于對數(shù)生長期時，常規(guī)收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1.2×105個/ml，每孔2 ml，接種至6孔板，每組2個復(fù)孔。培養(yǎng)16～18 h，細胞密度約 80%時吸棄陰性對照孔及PGK1轉(zhuǎn)染孔中原培養(yǎng)液，用 PBS 洗 1遍，更換為Opti-MEM培養(yǎng)基1.75ml。按照 Lipofectamine 3000 說明書要求，將 5 μl P3000和95ulOpti-MEM培養(yǎng)基充分混勻后再加入25ul(2.5 μg)重組質(zhì)粒/陰性質(zhì)粒，與含3.75ul Lipofectamine3000的Opti-MEM培養(yǎng)基125ul，充分混勻，室溫靜置 5 min，將250 μl混合液加入對應(yīng)孔中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染 4 h 后，更換為及血清及雙抗的 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng) 24后，除空白對照組外，其余3組更換為含有1.4mg/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)基，48h后每孔加入1mlTRIzol。

按照 TRIzol說明書提取其總 RNA，并將所得的 RNA 溶解于 RNase Free H2O。Nanodrop分光光度計測量RNA 濃度及純度，依據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)說明書取1μg 總 RNA 作為反轉(zhuǎn)錄模板，產(chǎn)物cDNA 再根據(jù)TAKARA 公司SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)說明書進行q PCR 操作每組3個復(fù)孔，內(nèi)參基因使用GAPDH。反應(yīng)體系為 cDNA 2.0 μl、RT Mix 10.0 μl、10 μmol/ L 的上下游引物各0.4 μl、Dye 0.4 μl、dd H2O 6.8 μl。Real-time PCR 反應(yīng)程序：95℃，30s；95℃，30s→60℃，30s，40個循環(huán)。

目的基因的相對表達量可以采用 ??CT 法分析，以正常組作為對照樣本。

△CT=目的基因 CT-內(nèi)參 CT(其中 CT 值為擴增 n 個循環(huán)基因的熒光數(shù)值)。

△△CT=觀察樣本?CT-對照樣本?CT=(觀察樣本目的基因 CT-觀察樣本內(nèi)參 CT)-(對照樣本目的基因 CT-對照樣本內(nèi)參 CT)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白定量(Western blot)檢測 6孔板接種SMMC7721細胞，分組及轉(zhuǎn)染方法同上。吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入120μl細胞蛋白裂解液 RIPA，充分裂解細胞，3 000 r/min 離心收集上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離，電壓80V，濃縮膠跑30min；電壓110V，分離膠跑60min。將分離膠上蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，加入相應(yīng)一抗，4℃ 過夜，TBST 洗 3次，每次 10 min，加入過氧化物酶標(biāo)記二抗，搖床搖 1.5 h，TBST 洗 3 遍，每次 10 min，最后進行ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析目標(biāo)蛋白的相對表達量，內(nèi)參蛋白使用GAPDH。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 MTT法檢測PGK1沉默對細胞增殖的影響 分組方法同上，常規(guī)體外培養(yǎng)SMMC7721細胞，待細胞處于對數(shù)生長期時，收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，每孔100μl，接種至4塊96孔板中，每組5個復(fù)孔。培養(yǎng)16～18 h，第1塊板加20μlMTT溶液孵育4h后，每孔更換為150μlDMSO，放置搖床上振蕩10min，酶標(biāo)儀檢測 490 nm 的吸光度(OD 值)。其余3快板，吸棄陰性對照孔及PGK1轉(zhuǎn)染孔中原培養(yǎng)液，用 PBS 洗 1遍，更換為Opti-MEM培養(yǎng)基100μl/孔。按照 Lipofectamine 3000 說明書要求，將 2.4μl P3000和45.6ulOpti-MEM培養(yǎng)基充分混勻后再加入12ul(1.2μg)重組質(zhì)粒/陰性質(zhì)粒，與含1.8ul Lipofectamine3000的Opti-MEM培養(yǎng)基60ul，充分混勻，室溫靜置 5 min，以10 μl/孔將混合液加入對應(yīng)的孔中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染 4 h 后，更換為含血清及雙抗的1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染12h后，3塊板中除空白對照組外，其余3組更換為含有1.4mg/ml G418的完全RPMI 1640培養(yǎng)基，并于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h分別進行MTT檢測。

2 結(jié)果

2.1 RTqPCR檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染72h后，PGK1RNAi組PGK1基因的相對表達量明顯低于其余各組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而G418組PGK1基因的相對表達量則明顯高于其余各組，比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖1。

2.2 Western blot檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染72h后，PGK1RNAi組PGK1蛋白的相對表達量低于其余各組，見圖2。

2.3 MTT檢測結(jié)果 隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，各組相比，G418組細胞的增殖速度最低，PGK1RNAi組細胞的增殖低于陰性組和正常組，見圖3。

圖1 各組細胞PGK1基因的相對表達圖

圖2 各組細胞PGK1基因的蛋白表達圖

圖3 各組細胞PGK1基因的增殖圖

3 討論

磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解過程中重要的催化酶之一，它可催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)的磷酸轉(zhuǎn)位到ADP而生成ATP。在原核和真核生物中，PGK的立體結(jié)構(gòu)高度保守，是典型的雙域結(jié)構(gòu)。人類的基因組中，PGK存在兩種亞型，PGK1和PGK2，兩者在功能上和結(jié)構(gòu)上都很相似。PGK1是X連鎖基因，在所有的體細胞中都有表達[4]。

德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心證實，在缺氧應(yīng)激、表皮生長因子受體(EGFR)活化或致癌基因KRas G12V/B-Raf V600E突變的情況下，PGK1會線粒體易位。進而導(dǎo)致線粒體中丙酮酸代謝被抑制，細胞質(zhì)中丙酮酸生成的乳酸增多。線粒體PGK1的蛋白激酶活性在于它是三羧酸(TCA)循環(huán)將丙酮酸從線粒體分流到細胞質(zhì)中以促進乳酸生成的關(guān)鍵。此外，功能研究表明，用線粒體易位缺陷的PGK1 S203A突變體替代內(nèi)源性PGK1可顯著降低原位移植在小鼠腦中的腫瘤的生長，這是由腫瘤細胞低增殖率和增強的凋亡引起的[5]。由此可見，PGK1作為糖酵解酶和蛋白激酶在腫瘤的能量代謝方面發(fā)揮著重要的作用，其在惡性腫瘤組織中高度表達，有助于滿足惡性腫瘤快速生長的需求。

本研究提示，在體外培養(yǎng)的肝癌細胞中，抑制PGK1基因的表達能夠減少肝癌細胞的增殖。若要進一步闡明PGK1基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，還需要更多的體內(nèi)實驗研究的支持。

[1] 陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅,等. 2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2015,24(1):1-10.

[2] 任紅艷,方肇勤,梁超,等.預(yù)知子、白花蛇舌草抑制肝癌細胞惡性增殖的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013,40 (12):2553-2555.

[3] 薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2001：128-138,705-749.

[4] Beutler E.PGK deficiency[J]. Br J Haematol， 2007,136(1):3-11.

[5] Li X, Jiang Y, Meisenhelder J,etal. Mitochondria-Translocated PGK1 Functions as a Protein Kinase to Coordinate Glycolysis and the TCA Cycle in Tumorigenesis[J]. Mol Cell， 2016,61(5):705-719.

EffectofPGK1silencingontheproliferationofSMMC7721hepatomacells

ZHANGYuan-yuan,FANGzhao-qin△.BasicMedicalSchool,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine(Shanghai,201203)China

ObjectiveTo investigate the effect of PGK1 gene silencing on the proliferation of SMMC7721 hepatoma cells.MethodsSMMC7721 hepatoma cells were cultured in vitro. Lipofectamine 3000 was used to transfect shRNA-PGK1 plasmid and SMMC7721 cells into SMMC7721 cells. The expression of PGK1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot. Cell viability was measured by MTT.ResultsCompared with normal 7721 cells, the expression of PGK1 in PGK1-silenced HCC cells was significantly decreased and the relative survival rate of PGK1 cells was decreased.ConclusionPGK1 gene silencing can inhibit the proliferation of SMMC7721 hepatoma cells.

Hepatocarcinoma cell; PGK1; RNA interference; Cell proliferation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.013

國家自然科學(xué)基金(No.81273641);中國博士后科學(xué)基金(No.2013M531201);上海市科委博士后科研基金項目(No.13R21415900);上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃(No.ZZszy13004)；△通迅作者

2017-03-22 編輯：程良斌)