雷 青 孟忠吉

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院感染科 (湖北 十堰， 442000)

鄂西北地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因型與耐藥突變的研究*

雷 青 孟忠吉△

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院感染科 (湖北 十堰， 442000)

目的：分析鄂西北地區(qū)慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基因分型與耐藥突變的分布及其臨床特點。方法回顧性研究2011.1-2016.11太和醫(yī)院感染科病房及門診基因測序法和基因芯片法檢測的324例慢性乙型肝炎患者的HBV基因型、常見核苷(酸)類似物(NAs)耐藥突變位點、肝功能指標(biāo)、HBV DNA定量及臨床特點等，并分析其相關(guān)性。結(jié)果基因測序法檢測238例，芯片法86例，其基因分型均以B型為主，基因芯片法中可以檢測到少量D型及混合基因型。共132例患者檢測出NAs 耐藥，耐藥突變位點以204位點最多見，B、C基因型耐藥率及臨床表現(xiàn)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，耐藥位點整體分布存在差異，但NAs耐藥分布一致，均以拉米夫定耐藥為主。結(jié)論鄂西北地區(qū)慢性乙型肝炎患者的HBV基因分型以B型為主，C型次之，B、C基因型患者耐藥突變位點的分布存在一定差異，但其耐藥率、臨床表現(xiàn)及NAs耐藥分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B型患者無NAs抗病毒治療史患者NAs耐藥率高于C型患者。

乙型肝炎；基因分型；耐藥突變

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，我國慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例[1]。抑制乙型肝炎病毒復(fù)制常用的藥物主要包括核苷(酸)類似物(NAs)和干擾素[2]，NAs耐藥突變是影響抗病毒療效的重要影響因素。同時，HBV的基因分型與慢性乙型肝炎患者的抗病毒療效及預(yù)后存在一定關(guān)聯(lián)[3，4]。本研究擬回顧性研究太和醫(yī)院2011-2016年收治的慢性乙型肝炎患者HBV基因分型、NAs耐藥突變及其臨床特點，分析三者的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 回顧性分析太和醫(yī)院感染科2011年1月-2016年11月門診及住院的有病毒學(xué)突破的慢性乙型肝炎患者的HBV基因分型、耐藥突變位點特征及臨床資料，共納入病例324例，其中男258例(79.63%)，女66例(20.37%)，平均年齡40.23±12.02歲。其中，基因測序法檢測238例，基因芯片法檢測86例。慢性乙型肝炎及病毒學(xué)突破的診斷符合我國2015年《慢性乙型肝炎防治指南》[2]，本研究符合倫理學(xué)要求。

1.2 檢測方法 2011年-2013年11月 HBV患者基因分型及耐藥突變位點檢測采用PCR直接測序法，2013年11月-2016年11月變更檢測方法，換為基因芯片法檢測，均由太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所檢測，檢測所需的TaqDNA聚合酶、DNA Mark均購自大寶生物工程有限公司，PCR循環(huán)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)和白蛋白(Alb)等肝功能指標(biāo)及HBV DNA定量均由太和醫(yī)院檢驗科檢測，所有數(shù)據(jù)均從臨床電子病歷系統(tǒng)及檢驗數(shù)據(jù)庫中調(diào)取。

1.3 耐藥突變位點 本研究中主要檢測了NAs常見的10個耐藥突變位點：173L、180M、181V、184AGIS、194TM、204VIS、207MIL、213T、236T、237H等。

2 結(jié)果

2.1 32例患者HBV基因型和耐藥情況 324例患者中HBV基因分型B型191例(58.95%)，C型112例(34.57%)，BC混合型8例(2.47%)，CD混合型7例(2.16%)，D型、BD型、BCD型各2例(各占0.62%)。共132例出現(xiàn)耐藥，占40.74%，其中B基因型耐藥77例(77/191，40.31%)，C型耐藥49例(49/112，43.75%)，B、C基因型患者耐藥率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X2=0.328，P=0.567)。出現(xiàn)耐藥的患者中25例(25/132，18.94%)未使用過NAs抗病毒治療，其中B型17例(17/77，22.08%)，C型4例(4/49，8.16%)，其他混合型共4例，B、C基因型患者天然耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=4.174，P=0.041)，見表1。

表1 患者基因型及NAs耐藥情況 [n(%)]

與B基因型比較，*P<0.05

2.2 B、C基因型NAs耐藥患者的臨床特點 B、C型患者的ALT、AST、TBil、Alb水平和HBV DNA定量等臨床指標(biāo)的比較顯示差異均無統(tǒng)計學(xué)意義見表2。其首發(fā)臨床癥狀均以乏力為主，其次為納差、尿黃、腹脹、惡心、腹痛等，不同基因型患者的臨床表現(xiàn)一致(χ2=3.174，P=0.673)，見表3。

表2 B、C基因型NAs耐藥患者的臨床指標(biāo)比較

表3 B、C基因型NAs耐藥患者首發(fā)臨床癥狀比較 [n(%)]

2.3 耐藥位點分布 132例NAs耐藥患者的耐藥突變位點檢測顯示：204位點突變72例(72/132, 54.55%，其中204I 53例，占73.61%)，180位點42例(31.82%)，236位點28例(21.21%)，181位點15例(14.56%)，204位點突變率最高，且以204I為主。

2.4 基因分型與耐藥突變位點的關(guān)系 B、C基因型各位點突變分別為204位點突變38例(49.35%)、34例(69.39%)，180位點20例(25.97%)、22例(44.9%)，181位點突變分別為6例(7.79%)、9例(18.37%)，236位點突變分別為24例(31.17%)、4例(8.16%)。此外，B基因型中還可見213位點突變5例、207位點突變4例，C基因型中檢測出237H位點突變2例，與180M和204I聯(lián)合出現(xiàn)。B、C基因型的耐藥突變位點均以204位點最多見，但二者耐藥位點的整體分布不全一致(χ2=23.469，P<0.0001)。

2.5 基因分型與核苷(酸)類似物耐藥情況 B、C基因型患者對核苷酸類似物耐藥以拉米夫定耐藥最多，分別為46例(59.74%)、38例(77.55%)；其次為替比夫定，B、C型耐藥分別是32例(41.56%)、21例(42.86%)；阿德福韋酯耐藥分別為25例(32.47%)，9例(18.37%)；B、C型中各檢出1例恩替卡韋耐藥，分別占1.3%和2.04%。替比夫定耐藥者均對拉米夫定耐藥。B、C基因型患者對核苷酸類似物的耐藥情況分布一致(χ2=6.549，P=0.088)。

3 討論

根據(jù)HBV全基因組核苷酸序列同源性≥92%或S基因序列同源性≥96%，目前已發(fā)現(xiàn)A-J共10個HBV基因型[5]，不同地域基因型分布存在一定差異，我國HBV基因分型以B、C型最常見，亦可見少量A和D型，南方地區(qū)以B型為主，北方以C型為主，新疆等少數(shù)民族可見基因D型[6]。本研究中，先后采用基因測序和基因芯片兩種方法檢測HBV基因分型，因基因測序法僅能測出優(yōu)勢基因型，故僅檢測出B型和C型，未能檢測出混合基因型，檢測結(jié)果與孟忠吉等[7]研究結(jié)果相吻合。隨著檢測方法的改進(jìn)，后續(xù)采用基因芯片法檢測基因分型，該技術(shù)可檢測出混合基因型，因此，使用基因芯片法檢測患者中B基因型所占比例明顯降低，但兩種方法檢測結(jié)果均顯示鄂西北地區(qū)HBV基因分型以B型為主，其次為C型，這與我國的基因型分布情況相一致。在本研究中還發(fā)現(xiàn)少量的D基因型，考慮與我市人口流動性較大相關(guān)。同時，本研究顯示B、C基因型患者的NAs耐藥率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這也與孟忠吉等[7]的研究結(jié)果相一致。

有研究顯示不同基因型的乙型肝炎患者的臨床表現(xiàn)及預(yù)后存在一定差異[4，8]， C基因型較B型患者發(fā)展成肝癌的風(fēng)險更大[9，10]。本研究中B、C基因型患者的ALT、AST、TBil、Alb水平及HBV DNA定量等臨床指標(biāo)及首發(fā)臨床癥狀無顯著差異，有待進(jìn)一步對這些患者進(jìn)行長期隨訪以分析評估不同基因型患者的遠(yuǎn)期預(yù)后的差異。

在本研究中共檢測了10個常見NAs耐藥位點，以204位點突變最為多見，其次依次為180、236和181位點，207、213等其他位點耐藥罕見。B、C基因型均以204位點耐藥突變最多，236、180位點的突變情況存在差異。但B、C基因型患者的NAs耐藥情況分布一致，均以拉米夫定耐藥最多見，其次為替比夫定、阿德福韋酯，恩替卡韋耐藥最少。這與NAs耐藥位點的分布有關(guān)，拉米夫定的耐藥位點以204為主，輔以180位點突變，阿德福韋酯耐藥突變位點為236和181位點，替比夫定耐藥位點為204I的突變，而B、C基因型均以204位點突變?yōu)橹?，尤其?04I，其耐藥突變位點的差異主要存在于180和236位點之間，因此，雖然B、C基因型患者的NAs耐藥突變位點的分布存在一定差異，但二者對NAs的耐藥情況分布一致，替比夫定耐藥者均對拉米夫定耐藥。本研究中，拉米夫定耐藥最為多見，一方面，這與拉米夫定上市早，價格相對低廉，使用率高有關(guān)；另一方面，也因為拉米夫定的主要耐藥基因YMDD變異與HBV DNA聚合酶的基因突變有關(guān)。

此外，本研究中B、C基因型NAs耐藥者中均存在無NAs抗病毒用藥史患者，且B型患者中無NAs用藥史但出現(xiàn)NAs耐藥的患者比例高于C型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明部分患者存在天然核苷酸類似物耐藥情況，且在B型中更多見。但B、C基因型患者的總體耐藥率無統(tǒng)計學(xué)差異，是否能說明在使用NAs后B型患者發(fā)生NAs耐藥的幾率較C型的更小，還需大樣本、遠(yuǎn)期的隨訪進(jìn)一步證實。

總之，鄂西北地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因分型以B型為主，C型多見，亦可見少許D型及混合型，NAs耐藥突變位點以204位點突變最常見，尤其是204I，以拉米夫定耐藥為主，B、C兩種基因型患者的臨床表現(xiàn)無顯著差異，核苷酸類似物耐藥情況分布一致，但其耐藥突變位點分布存在差異，且B、C基因型無NAs抗病毒治療史患者均存在天然NAs耐藥現(xiàn)象，B型的發(fā)生率更高，有NAs抗病毒治療史者B型較C型耐藥率更低，其遠(yuǎn)期預(yù)后的差異有待進(jìn)一步研究。在使用NAs抗病毒的基礎(chǔ)上檢測基因分型及NAs耐藥情況對乙型肝炎的精準(zhǔn)治療具有一定的指導(dǎo)意義。

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StudyofHBVgenotypesanddrugresistancemutationsinpatientswithchronichepatitisBinnorthwestofHubeiProvince

LEIQing,MENGZhong-jiΔ.DepartmentofInfectiousDiseases,TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine(ShiyanHubei, 442000)China

Objective:To investigate the distribution and clinical characteristics of hepatitis B virus (HBV) genotypes and drug resistance mutations in patients with chronic HBV infection in northwest of Hubei Province.MethodsFrom Jan 2011 to Nov 2016,a total of 324 patients with Hepatitis B who were admitted to the department of infectious diseases of Taihe Hospital, Hubei University of Medicine

HBV genotyping and drug resistance mutations analysis by gene sequencing or gene chipassay.HBV genotypes, common mutation sitesrelated tonucleoside (acid) analogues (NAs), liver function index, HBV DNA viral loads and clinical characteristics of patients were extracted from clinical databases of Taihe Hospital, Hubei University of Medicine.The relationships among these parameters were statistically analyzed.ResultsHBV genotypes of 238 samples were detected by gene sequencing, and the other 86 cases by gene chip assay.Genotype B was the most common genotype, and a few of type D and mixed genotypes could be detected by gene chip assay.A total of 132 patients were found to have NAs related resistant mutant, and the most common mutation was M204I/V.There were no significant difference between genotype B and C in the rate of NAs related resistance and clinical manifestations.The profiles of the NAs-related mutations were different, while the distribution of NAs-related resistance were consistent, with lamivudine resistance primarily.ConclusionGenotype B was the most common HBV genotype in northwest of Hubei province, followed by genotype C.There were some differences between the genotype B and C in the distribution of NAs-related resistant mutation sites, but nostatistical difference was found in the rate of NAs-related resistant, clinical manifestations, or the distribution of NAs-related resistance.NAs-related resistance rate in patients without NAs antiviral treatment history was much higher in genotype B than that ingenotype C patients.

Hepatitis B; genotype; drug resistant mutation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.003

湖北省科技廳自然科學(xué)基金(No.2014CFB645)，湖北省教育廳重大項目(No.Z20102101)；△通信作者，E-mail:zhongjimeng@163.com

，2017-03-22 編輯：程良斌)

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