楊紅星,李紹旦 綜述 楊明會 審校

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指在原發(fā)或繼發(fā)的缺血性心臟疾病中恢復(fù)心肌缺血部位的血液供應(yīng)后卻加劇了缺血心肌的應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡的病理生理過程。導(dǎo)致MIRI的具體機(jī)制是復(fù)雜的，包括營養(yǎng)缺乏、再灌注活性氧應(yīng)激、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、再灌注導(dǎo)致的鈣紊亂、心肌細(xì)胞內(nèi)pH值的快速變化[1]等，MIRI往往是它們多方面作用的結(jié)果。

自噬是高度進(jìn)化保守的細(xì)胞內(nèi)降解長壽命蛋白和受損細(xì)胞器的生理反應(yīng)。自噬是細(xì)胞內(nèi)依賴溶酶體的“自我消化”行為，能夠清除胞質(zhì)內(nèi)入侵病毒、大分子異常蛋白和衰老受損細(xì)胞器[2]，是細(xì)胞內(nèi)固有的應(yīng)激反應(yīng)和防御機(jī)制。自噬與心血管或肌肉組織疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、衰老和腫瘤等多種疾病有關(guān)。根據(jù)包裹物和運(yùn)輸方式不同，可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)，以及新發(fā)現(xiàn)的DNA自噬[3]和RNA自噬[4]，通常所謂的自噬是指巨自噬。心肌細(xì)胞通過自噬途徑降解受損的線粒體等細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)能量平衡與環(huán)境穩(wěn)定，從而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。不少研究均已確定，自噬參與了MIRI的病理過程，并發(fā)揮著有益或有害的不同效應(yīng)[5]。綜合性的研究[6]認(rèn)為，再灌注期自噬的具體作用可能與缺血期缺血程度、缺血時間、自噬的激活程度、自噬與凋亡之間的交互作用、甚至所用模型和評價自噬的方法等有關(guān)。另外，自噬的具體作用還可能與誘發(fā)因素有關(guān)，營養(yǎng)缺乏、缺氧、感染、活性氧應(yīng)激等不同的誘發(fā)因素，可導(dǎo)致自噬完全不同的作用。顯然自噬能夠相應(yīng)地改變?nèi)毖俟嘧p傷程度并對損傷心肌具有潛在的保護(hù)作用。因此深入研究自噬機(jī)制和調(diào)控通路十分重要。

1 MIRI中自噬的調(diào)控機(jī)制

1.1AMPK途徑5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)即AMP依賴的蛋白激酶，是生物體能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。心肌缺血缺氧導(dǎo)致ATP水平下降，激活A(yù)MPK而誘導(dǎo)自噬。心肌缺血時以ATP為代表的能量水平下降， AMPK感知能量不足后被激活，誘發(fā)ULK1活化，啟動自噬起始環(huán)節(jié)[7]。例如PL菌絲體預(yù)處理部分地通過增加AMPK磷酸化水平上調(diào)自噬減少大鼠MIRI[8]。

1.2mTOR途徑雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是心肌缺血階段調(diào)控自噬的核心蛋白，作為胞內(nèi)能量感受體，它有兩種復(fù)合物形式：mTORC1和mTORC2，諸多調(diào)控方式通過抑制mTOR上調(diào)自噬緩解MIRI。例如，升高miRNA-221表達(dá)量能夠通過mTORC1/p-4EBP1途徑抑制自噬從而緩解缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的H9c2心肌細(xì)胞和新生大鼠心肌細(xì)胞損傷[9]。黃連素降低mTORC2磷酸化水平后進(jìn)而抑制自噬顯著提高了H9c2心肌細(xì)胞存活率，減少了小鼠心肌梗死面積[10]。

1.3HIF-1參與的缺氧誘導(dǎo)自噬調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，其中HIF-1α是缺氧期間的調(diào)節(jié)亞基。缺氧/復(fù)氧模型能顯著提高HIF-1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。例如HIF-1α過表達(dá)或敲低可分別促進(jìn)或抑制缺氧引起的自噬誘導(dǎo)，從而證實(shí)HIF-1介導(dǎo)的自噬能夠減輕缺氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的降低[11]。

1.4活性氧和鈣活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)廣泛參與缺血再灌注后的損傷，是MIRI最重要的作用機(jī)制之一。再灌注期大量的ROS干擾線粒體膜極性與膜的完整性，增加線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，或?qū)NA造成損傷，導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡或自噬性死亡增加[12]。鈣和鈣調(diào)蛋白在MIRI中也是誘導(dǎo)自噬的因素，MIRI中抑制Na+/Ga2+離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白就可以減少線粒體鈣超載從而降低過高的自噬水平[13]。再灌注期細(xì)胞膜Na+/Ga2+交換通道開放增加，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，通過mTOR依賴途徑進(jìn)一步增強(qiáng)自噬。且肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度從而抑制自噬，表明Ca2+濃度可影響再灌注期自噬水平[14]。

1.5NF-κB參與NF-κB是最初于B淋巴細(xì)胞中鑒定出的一種核轉(zhuǎn)錄因子，能夠被感染、ROS等多種刺激因素誘導(dǎo)入核，上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控炎癥反應(yīng)、凋亡與自噬水平。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷能夠促進(jìn)依賴于p65-Beclin1的自噬水平升高，而抑制NF-κB可以降低 Beclin1參與的自噬流活化程度，增加細(xì)胞損傷[15]。

1.6內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)MIRI過程中，ROS干擾胞內(nèi)代謝平衡，擾亂了位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白折疊過程，激起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)同樣參與其中。ERS和UPR能夠選擇性地減少蛋白質(zhì)翻譯及合成、誘導(dǎo)自噬對已經(jīng)錯誤折疊的蛋白質(zhì)的清理，并能夠通過UPR三個信號傳感器IRE1、PERK和 ATF6將信號(例如通過真核啟動因子eIF2α)傳遞到細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)引發(fā)自噬[16]。

MIRI中自噬的調(diào)控機(jī)制與作用是多方面的，因此在MIRI中通過調(diào)控自噬處于恰當(dāng)?shù)乃斤@示了對MIRI的良好治療前景。在MIRI和自噬機(jī)制中，microRNA近年來越來越引起人們的關(guān)注。microRNA是高度保守的長度為18～24個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，被認(rèn)為具有與靶mRNA的特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后促進(jìn)降解或抑制靶mRNA翻譯來行使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。microRNA在細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等方面具有重要的調(diào)控作用，而且，microRNA在心血管系統(tǒng)疾病過程包括MIRI中扮演了重要角色。因此，深入探索microRNA在MIRI中的作用與詳細(xì)機(jī)制具有十分重要的臨床意義。目前已報道多種microRNA通過調(diào)控自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,ATG)或自噬調(diào)節(jié)因子干預(yù)自噬水平，在MIRI中扮演了重要角色。因此本文著重綜述microRNA通過調(diào)節(jié)自噬進(jìn)而緩解MIRI的作用與機(jī)制。

2 microRNA調(diào)節(jié)自噬的不同環(huán)節(jié)

自噬的具體機(jī)制包括自噬的誘發(fā)、自噬泡開始形成、自噬泡延伸并識別包裹待降解的胞質(zhì)成分、自噬泡與溶酶體融合、降解自噬泡內(nèi)容物以供能量循環(huán)利用[17]。microRNA能夠通過不同途徑調(diào)控自噬的絕大部分過程。

2.1自噬的誘發(fā)階段哺乳動物細(xì)胞自噬的發(fā)生常見于能量危機(jī)或激素、生長因子、鈣離子、Bcl-2、ROS誘導(dǎo)時，始于mTOR或classIIIPI3K活化，導(dǎo)致ULK復(fù)合物(包括Atg1、Atg13、Atg17、Atg101)的激活。有研究[18]證實(shí)，miRNA-21在H9c2心肌細(xì)胞中激活A(yù)kt/mTOR通路,可能通過抑制ULK復(fù)合物下調(diào)缺氧/復(fù)氧模型的自噬流而減少細(xì)胞凋亡。miRNA-20a和miRNA-106b在C2C12成肌細(xì)胞中通過抑制ULK1的活化下調(diào)自噬[19]。另據(jù)報道m(xù)iR-93能夠靶向調(diào)控ULK1并在缺氧條件下降低其蛋白表達(dá)水平從而抑制自噬[20]。

2.2自噬泡的形成與延伸初始自噬膜的形成需要PtdIns3K復(fù)合物的活化，它由PtdIns3K、Vps34、Vps15、Atg14和Atg6/Vps30(哺乳動物中的同系物Beclin1)組成。自噬泡的成核涉及包含PIK3C3/VPS34-PIK3R4/VPS15(磷酸肌醇-3-激酶)-BECN1-ATG14的磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K)復(fù)合物[21]。PtdIns3K復(fù)合物產(chǎn)生PtdIns3P(3磷酸-磷脂酰肌醇)，并募集多個自噬蛋白如Atg18、Atg20、Atg21和Atg24 (100,105,141)而成核，進(jìn)而募集兩個泛素樣蛋白酶體Atg12-Atg5-Atg16和Atg8(在哺乳動物中的同系物就是LC3蛋白，是自噬活化的標(biāo)記蛋白)-PE，促進(jìn)自噬小體的膜伸長和擴(kuò)大[22]。其中值得重點(diǎn)關(guān)注的是Atg8也就是LC3蛋白的羧基末端被蛋白酶Atg4B切割后形成胞質(zhì)蛋白形式LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ進(jìn)一步被磷脂酰乙醇胺脂化成為LC3-Ⅱ形式，后者可被募集到自噬泡膜上。通常由LC3-Ⅱ與LC3-I的比值可以評價自噬的活化程度。miRNA-30a、miRNA-376b[23]和miRNA-519a[24]抑制Beclin1從而抑制自噬泡初期的成核作用。miRNA-93能夠阻止LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,阻止它們被募集到自噬泡膜上從而起到抑制自噬體膜延展的作用[20]。有研究[25]顯示，一種被稱為ARC的抗自噬蛋白的靶標(biāo)是Beclin1，而miR-325能夠通過抑制ARC進(jìn)而抑制Beclin1下調(diào)自噬。Atg14是Ptdlns3(磷脂酰肌醇)激酶3復(fù)合物之一的特異性亞單位，能夠?qū)tdlns3復(fù)合物靶向?qū)?biāo)自噬體形成的可能位點(diǎn)，因此對自噬初始階段成核作用十分重要。有研究[26]認(rèn)為抑制miRNA-130a能夠上調(diào)Atg14水平，激活自噬而緩解新生SD大鼠心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷。miRNA-181a和miRNA-374a[24]通過抑制Atg5下調(diào)自噬。miRNA-375[27]通過負(fù)性調(diào)控Atg7抑制兩個泛素蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的自噬泡的延伸。類似地，miRNA-630通過抑制Atg12，阻止泛素蛋白酶體系統(tǒng)形成Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物，抑制自噬膜的延展[24]。

2.3自噬體與溶酶體的融合自噬體成熟后，其雙層膜的外膜和溶酶體膜融合為一，內(nèi)膜以及自噬體內(nèi)容物一起被溶酶體酶降解——所得的單層膜囊泡被稱為自噬溶酶體。這種融合依賴于細(xì)胞內(nèi)微管，由Rab7-SNARE、SKD1等蛋白以及溶酶體膜蛋白LAMP1/2參與。此外UVRAG可與PtdIns3K復(fù)合物結(jié)合,激活GTPaseRAB7后,促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合[22]。研究[28]顯示成熟自噬體膜上存在一種被稱為syntaxin 17的SNARE,通過與SNAP29和SNARE VAMP8相互作用促進(jìn)了自噬溶酶體的形成。目前盡管沒有發(fā)現(xiàn)直接作用于自噬體和溶酶體融合階段的miRNA，但miRNA-98、miRNA-124、miRNA-130、miRNA-142、miRNA-204等可能通過抑制LAMP1/2和V-SNARE蛋白和囊泡相關(guān)膜蛋白7(VAMP7)，對自噬起負(fù)調(diào)控作用。例如，最新證實(shí)miRNA-33的直接靶標(biāo)即包含溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1并能降低其表達(dá)，從而顯示出抑制自噬的作用[29]。此外，UVRAG作為一種促自噬蛋白，能夠通過調(diào)控Vps復(fù)合體，使RAB7活性增強(qiáng)，促進(jìn)自噬溶酶體的形成，miRNA-630和miRNA-374能夠調(diào)控UVRAG，則可推測該2個miRNA在促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合過程中扮演了重要角色[30]。

3 結(jié)語

近年來自噬研究呈明顯增加的趨勢，從自噬的誘發(fā)到自噬體與溶酶體融合過程中不斷有新的自噬基因被鑒別出來，自噬的調(diào)控因素也不斷被深入研究。microRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要形式，在各類細(xì)胞自噬中舉足輕重。雖然microRNA直接參與自噬體與溶酶體融合過程中的研究尚有不足，但是很多microRNA通過更廣泛的間接調(diào)控干預(yù)自噬。隨著人們對microRNA調(diào)控自噬機(jī)制研究的不斷深入，通過microRNA與自噬機(jī)制作為直接或間接藥物靶點(diǎn)或干預(yù)策略將越來越清晰地展現(xiàn)出其臨床應(yīng)用前景。