[摘 要] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān) 鍵 詞] ELISA實(shí)驗(yàn)；問(wèn)題；注意事項(xiàng)

[中圖分類號(hào)] G712 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [文章編號(hào)] 2096-0603（2017）33-0113-01

用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清（漿）。本實(shí)驗(yàn)室用ELISA測(cè)定乙肝兩對(duì)半、甲肝、戊肝、抗HIV的標(biāo)本時(shí)，在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

1.要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞時(shí)，反應(yīng)孔不易洗凈，殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的活性，顯色時(shí)可能造成假陽(yáng)性。

2.標(biāo)本凝固不全強(qiáng)行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結(jié)果。

3.血清標(biāo)本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長(zhǎng)時(shí)間保存，則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免反復(fù)凍融，標(biāo)本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標(biāo)本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩，應(yīng)反復(fù)顛倒混勻。

二、ELISA測(cè)定中試劑準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后再進(jìn)行測(cè)定，試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來(lái)直接做實(shí)驗(yàn)，會(huì)導(dǎo)致一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。在后面的孵育反應(yīng)步驟中，造成孵育時(shí)間不夠。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

三、加血清樣本及反應(yīng)試劑

血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點(diǎn)：

1.加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時(shí)，加樣槍需按到第一檔；加樣時(shí)，加樣槍需直接按到底。

2.加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部，加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染，盡量避免出現(xiàn)氣泡。

3.反應(yīng)試劑加入時(shí)先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易重復(fù)滴加或加在兩孔之間。

四、溫育的時(shí)間與溫度

溫育是ELISA測(cè)定中最容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃，水浴。溫育時(shí)間應(yīng)按照試劑說(shuō)明書上的時(shí)間嚴(yán)格執(zhí)行。溫育實(shí)際測(cè)定操作中要注意以下幾點(diǎn)：

1.要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)。

2.因?yàn)椴捎盟?，所以在溫育時(shí)一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染。

五、ELISA測(cè)定的洗板

全自動(dòng)洗板機(jī)的使用應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1.洗板前，應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶。

2.在自檢過(guò)程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

3.在洗板過(guò)程中，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無(wú)外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時(shí)間。

六、ELISA測(cè)定以TMB為底物的顯色

加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定判斷結(jié)果。在此過(guò)程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則需要重做實(shí)驗(yàn)。

七、ELISA的比色測(cè)定

ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，故需強(qiáng)調(diào)比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否是雙波長(zhǎng)（450nm和630nm）。

八、ELISA測(cè)定結(jié)果判定

結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定，如在判定過(guò)程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽(yáng)的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見(jiàn)的模式（如乙肝兩對(duì)半中出現(xiàn)12陽(yáng)性等），需本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，重新復(fù)查。

對(duì)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因（非試劑盒本身的原

因），總結(jié)如下：

1.弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題。

2.測(cè)定的重復(fù)性差，這是由于測(cè)定操作引起的問(wèn)題，包括：（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；（2）加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；（3）加錯(cuò)樣本；（4）加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁；（5）不同批號(hào)試劑盒中組分混用；（6）溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；（7）孔內(nèi)污染雜物。

血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固

或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。

3.全部孔都不顯色。（1）漏加酶結(jié)合物；（2）洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題；（3）漏加顯色劑A或B；（4）終止劑當(dāng)顯色劑使用。

4.全部板孔均有顯色。（1）板不干凈；（2）顯色液變質(zhì)；（3）洗板液受酶等污染。

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