張磊 寧玉輝 李國順 何濤 牟宗友 李明 郭金泉

. 論著 Original article .

敲低 SOX5 對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞生物學功能的影響

張磊 寧玉輝 李國順 何濤 牟宗友 李明 郭金泉

目的 探討轉(zhuǎn)錄因子 SOX5 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的生物學功能。方法 分離培養(yǎng)人骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 軟骨細胞；運用脂質(zhì)體 2000 轉(zhuǎn)染法將 siSOX5 轉(zhuǎn)染 OA 軟骨細胞 ( OA-siSOX5 )，以轉(zhuǎn)染 NCsiRNA 為陰性對照 ( OA-NCsiRNA )；運用 Real time PCR 檢測轉(zhuǎn)染的 OA 軟骨細胞中 SOX5、白介素 6( IL-6 )、白介素 1β ( IL-1β )、II 型膠原 ( COL2A1 ) 及蛋白多糖 ( ACAN ) mRNA 的表達水平；酶聯(lián)免疫法( ELISA ) 檢測 OA 軟骨細胞培養(yǎng)上清中 IL-6 和 IL-1β 濃度；Western blot 檢測 SOX5、基質(zhì)金屬蛋白酶 1( MMP-1 ) 和 MMP-13 蛋白表達水平；運用 AnnexinV-FITC 及流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果 OA-siSOX5細胞中 IL-6 ( 0.72±0.05 ) 和 IL-1β mRNA ( 0.64±0.07 ) 表達顯著低于 OA-NCsiRNA 細胞 ( 1.32±0.08、1.64±0.09 ) (P＜0.05 )；COL2A1 ( 1.27±0.08 ) 和 ACAN mRNA ( 2.38±0.17 ) 顯著高于 OA-NCsiRNA 細胞 ( 0.58±0.04，1.25±0.10 )，(P＜0.05 )；OA-siSOX5 細胞中 IL-6 ( 175.2±14.5 ) pg / ml 和 IL-1β ( 102.6±20.3 ) pg / ml濃度顯著低于 OA-NCsiRNA 細胞 [ ( 584.6±74.5 ) pg / ml 和 ( 268.4±25.3 ) pg / ml ) ](P＜0.05 )；細胞凋亡率OA-siSOX5 [ ( 3.04±0.86 ) % ]顯著低于 OA-NCsiRNA 細胞 [ ( 18.35±2.74 ) % ](P＜0.05 )；OA-siSOX5 細胞中MMP-1 ( 0.53±0.05 ) 和 MMP-13 蛋白水平 ( 0.46±0.08 ) 明顯低于 OA-NCsiRNA 細胞 ( 1.95±0.11、2.48±0.24 )(P＜0.05 )。結(jié)論 下調(diào) SOX5 表達可能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達、促進細胞外基質(zhì)的合成與分泌、抑制細胞凋亡和炎癥反應進而緩減 OA 的發(fā)展。

骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；SOX5；MMPs；細胞凋亡

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 是常見的一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，好發(fā)于中老年人，骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)腫痛和活動受限是 OA 的主要臨床特征，是導致老年人死亡率和致殘率增高的主要原因之一[1]。目前 OA 的發(fā)病機制仍不清楚，研究發(fā)現(xiàn) OA 有一定的遺傳易感性[2-3]，機制研究發(fā)現(xiàn) OA 的病理改變?yōu)檐浌瞧茐?，而軟骨破壞的核心環(huán)節(jié)是軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)代謝的失衡，使分解代謝超過合成代謝[4]。因此，尋找能抑制軟骨基質(zhì)的分解代謝、促進合成代謝的新靶點，研發(fā)特異性治療 OA 的靶向小分子藥迫在眉睫。最新研究發(fā)現(xiàn)隨轉(zhuǎn)錄因子 SOX5( Transcription factor SOX-5 ) 在 OA 患者滑膜組織、骨關(guān)節(jié)液中高表達，炎癥因子 TNF-α 通過促進人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中 SOX5 與破骨細胞分化因子( RANKL ) 的啟動子結(jié)合，誘導 RANKL 表達。體外研究發(fā)現(xiàn)沉默 SOX5 的表達明顯改善軟骨破壞程度[5]，提示 SOX5 在 OA 病理過程中發(fā)揮重要作用，但其作用機制尚不清楚。本研究以體外培養(yǎng)的人 OA 軟骨細胞為研究對象，siRNA 沉默 SOX5 表達后觀察軟骨細胞凋亡，細胞上清中炎癥因子的變化，膠原合成以及基質(zhì)蛋白的表達水平，探索 SOX5 在 OA 發(fā)中的作用及分子機制，為以 SOX5 為靶點研發(fā)治療 OA 的靶向藥物提供科學依據(jù)。

材料與方法

一、標本與試劑

用于分離培養(yǎng)的人軟骨細胞的關(guān)節(jié)軟骨片來源于我院骨關(guān)節(jié)矯形中心作全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù) OA患者；DMEM 培養(yǎng)基 ( Gibco )、胎牛血清 ( FBS )、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒購自 BD公司；MMP-1 多克隆抗體、MMP-13 多克隆抗體購自 Abcam 公司；β-actin 單克隆抗體、SOX5單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( Prime Script?RT reagent kit with gDNA Eraser )、Real-time PCR 試劑盒 ( SYBR?Premix Ex TaqTM II ) 購于 Takara 公司；AnnexinV-FITC / PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自南京博泰生物技術(shù)有限公司；設(shè)計 siSOX5 及陰性對照 ( NCsiRNA ) 片段，由上海生工合成；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo 公司。

二、方法

1. OA 軟骨細胞的分離培養(yǎng)：用無菌 D-hanks液將軟骨組織徹底清洗干凈，剪成碎片，置于培養(yǎng)瓶中，加入約 5 ml 0.25% 胰酶，于二氧化碳培養(yǎng)箱( NUNR3，20PSI ) 中震蕩消化 30 min；棄掉培養(yǎng)基，加入約 5 ml 0.2% II 型膠原酶，于二氧化碳培養(yǎng)箱中震蕩消化過夜，每 6～8 h 收集 1 次細胞；棄掉 II 型膠原酶，用 200 目濾網(wǎng)過濾，濾液轉(zhuǎn)移至離心管中離心 ( Eppendorf，5427R )，離心半徑 5 cm，3000 rmp，4 ℃，離心 5 min，去上清；用 DMEM 培養(yǎng)基 ( 含 10% FBS ) 洗滌 2 次，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入 5 ml DMEM 培養(yǎng)基 ( 含 20% FBS，1% 雙抗 ) 培養(yǎng)，48 h 換液。當細胞密度達到 80% 左右時進行細胞傳代，用于后續(xù)實驗。

2. siRNA 合成和細胞轉(zhuǎn)染：針對 SOX5 基因開放閱讀框序列，運用 Ambion 公司的網(wǎng)上在線軟件( http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html ) 設(shè)計 siSOX5，同時設(shè)計陰性對照 NCsiRNA，由上海生工合成。將生長良好的第 3 代 OA 軟骨細胞以細胞密度為 2×105個 / 孔接種到 6 孔板中，待細胞融合度達到 80%～90% 時按照脂質(zhì)體 2000 說明書進行轉(zhuǎn)染。先用無血清 OptiMEM 培養(yǎng)液將脂質(zhì)體2000 稀釋，配置 10 μm / ml siSOX5，然后將等體積脂質(zhì)體 2000 和 siSOX5 混勻，室溫靜置 10 min 后加入細胞中使 siRNA 終濃度為 20 nm / ml，培養(yǎng) 4 h 換成完全培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)染 NCsiRNA 為陰性對照，轉(zhuǎn)染的細胞命名為 OA-siSOX5 和 OA-NCsiRNA 細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

3. Real-time RT-PCR：轉(zhuǎn)染的第 3 代 OA 細胞培養(yǎng)后 48 h 收集細胞，按照 TRIzol 試劑說明書提取總 RNA，濃度測定，保存于 -80 ℃。按照 RT-PCR試劑盒說明書合成 cDNA，反應條件為 42 ℃，1 h；70 ℃，5 min；4 ℃ 放置 10 min，cDNA 置于 -80 ℃保存。取 2 ng cDNA 進行 Real-time PCR 反應，擴增引物見表1。反應條件為：95 ℃ 預變性 5 min；95 ℃，25 s；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。運用 SYBR Green II 熒光染料法和 IQ5TM Real-Time PCR Detection System ( Bio-rad )進行 Real-time PCR 數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng) β-actin 校正，IL-6、IL-1β、II 型膠原 ( COL2A1 ) 及蛋白多糖( ACAN ) mRNA 的相對表達量用 2-△△Ct表示。

4. ELISA 檢測細胞上清中細胞因子的濃度：轉(zhuǎn)染的 OA 細胞分別在 0 h、12 h、24 h、48 h、72 h 收集細胞培養(yǎng)上清，12 000 rmp，4 ℃，離心 10 min，離心半徑 5 cm，收集上清于干凈的 EP 管中，按照 ELISA 試劑盒說明書測定 IL-6 和 IL-1β 的濃度( pg / ml )。

表1 Real time PCR 擴增引物序列Tab.1 Real time PCR

5. 細胞凋亡：OA-siSOX5 和 OA-NCsiRNA 細胞培養(yǎng)于 1% FBS DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 72 h 棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌，用無 EDTA 的胰酶消化收集細胞，加入 PBS 制成細胞懸液。按照 Annexin V-FITC /PI 試劑盒說明書操作，先加入 500 μl Binding buffer重懸細胞，再加入 5 μl FITC 標記的 Annexin-V 和5 μl PI 混勻，室溫下避光孵育 15 min，流式細胞儀( Bio-Rad，s3e ) 檢測細胞凋亡。

6. Western blot：OA-siSOX5 和 OA-NCsiRNA 細胞培養(yǎng) 48 h 經(jīng)消化、離心，離心半徑 5 cm，1000 rmp，離心 3 min，收集細胞，用 RIPA ( 50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS ) 重懸細胞，超聲破碎、12 000 rmp，4 ℃離心 10 min，離心半徑 5 cm，按照 BCA 試劑盒說明書測定總蛋白濃度。每個樣本取 50 μg 進行 SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到 NC 膜上，10% 脫脂奶粉室溫封閉，分別孵育一抗 ( SOX5、MMP-1、MMP-13 )，以 β-actin 為內(nèi)參，4 ℃ 過夜。TBST 洗膜、孵育二抗，室溫孵育 1 h。ECL 顯影后掃描，蛋白相對表達量經(jīng)內(nèi)參校正后經(jīng) Image J 軟件分析。

三、統(tǒng)計學處理

每個實驗進行 3 次獨立重復試驗。應用 SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用±s表示，組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA )，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 OA 細胞的分離培養(yǎng) ( × 40 ) a：剛分離的 OA 細胞；b：培養(yǎng) 2 天的 OA 細胞；c：培養(yǎng) 12 天的 OA 細胞；d：傳代培養(yǎng)的 OA 細胞Fig.1 OA cells were isolated and cultured ( × 40 ) a: OA cells just separated; b: OA cells cultivated 2 days; c: OA cells cultivated 12 days;d: Subcultured OA cells

結(jié) 果

一、OA 細胞的形態(tài)學觀察

剛分離的原代軟骨細胞呈大小均一、折光性較強的球形 ( 圖1a )；培養(yǎng)后 2 天軟骨細胞完全貼壁變形，呈星形、多角形 ( 圖1b )；培養(yǎng) 12 天時細胞數(shù)量增多、生長旺盛，細胞密度增大，細胞之間間隙較大 ( 圖1c )；傳代后，軟骨細胞均生長旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定，OA 軟骨細胞交織成網(wǎng)狀( 圖1d )。

二、下調(diào) SOX5 表達對關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

結(jié)果如圖2 所示，OA 軟骨細胞轉(zhuǎn)染 siSOX5后，Real time PCR 和 Western blot 結(jié)果表明 SOX5的 mRNA 和蛋白水平顯著下降，與陰性對照組( NCsiRNA ) 比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01 )。Real time PCR 結(jié)果顯示 IL-6、IL-1β mRNA 在 OA軟骨細胞中的相對表達水平分別為 1.32±0.08、1.64±0.09，COL2AI、ACAN mRNA 的相對表達水平分別為 0.58±0.04、1.25±0.10。沉默 SOX5 的表達顯著減少 IL-6、IL-1β 的 mRNA 水平，相對表達水平分別為 0.72±0.05、0.64±0.07；促進COL2AI、ACAN 的 mRNA 水平，相對表達水平分別為 1.27±0.08、2.38±0.17，分別與 NCsiRNA 比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )。

三、下調(diào) SOX5 表達對 IL-6 和 IL-1β 濃度的影響

ELISA 結(jié)果如圖3 顯示，SOX5 下調(diào)的 OA 軟骨細胞培養(yǎng)上清中 IL-6 和 IL-1β 濃度分別為 ( 175.2±14.5 ) pg / ml 和 ( 102.6±20.3 ) pg / ml，顯著低于陰性對照組 ( IL-6 和 IL-1β 濃度分別為 ( 584.6±74.5 ) pg / ml 和 ( 268.4±25.3 ) pg / ml，差異有統(tǒng)計學意義 (t1＝35.224，t2＝19.782，P均＜0.05 )。提示SOX5 低表達抑制 OA 軟骨細胞中 IL-6 和 IL-1β 的合成及分泌。

四、下調(diào) SOX5 表達對 OA 軟骨細胞凋亡的影響

結(jié)果如圖4 所示，SOX5 低表達的 OA 軟骨細胞凋亡率為 ( 3.04±0.86 ) %，顯著高于陰性對照組 OA軟骨細胞 [ 細胞凋亡率為 ( 18.35±2.74 ) % ]，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )，提示 SOX5 低表達能抑制OA 軟骨細胞凋亡。

五、下調(diào) SOX5 表達對 OA 軟骨細胞對 MMPs蛋白表達的影響

圖2 下調(diào) SOX5 表達對關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 ( 與 NCsiRNA 組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 )圖3 下調(diào) SOX5 表達對 IL-6 和 IL-1β 濃度的影響 ( 與 NCsiRNA 組比較，**P ＜ 0.01 )Fig.2 Effects of down-regulated SOX5 expression on the transcription of key target genes ( Compared with NCsiRNA group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01 )Fig.3 Effects of down-regulated SOX5 expression on concentrations of IL-6 and IL-1β ( Compared with NCsiRNA group, **P ＜ 0.01 )

圖4 下調(diào) SOX5 表達對 OA 軟骨細胞凋亡的影響 ( 與 NCsiRNA組比較，**P ＜ 0.01 )Fig.4 Effects of down-regulated SOX5 expression on the apoptosis of OA chondrocytes ( Compared with NCsiRNA group, **P ＜ 0.01 )

圖5 下調(diào) SOX5 表達對 OA 軟骨細胞對MMPs 蛋白表達的影響 ( 與 NCsiRNA 組比較，**P ＜ 0.01 )Fig.5 Effects of down-regulated SOX5 expression on the expression of MMPs protein in OA chondrocytes ( Compared with NCsiRNA group, **P ＜ 0.01 )

結(jié)果如圖5 所示，SOX5 低表達顯著抑制 MMP-1和 MMP-13 蛋白表達，與 NCsiRNA 組比較，siRNA介導 OA 軟骨細胞中的 SOX5 蛋白水平下降了3.5 倍，MMP-1 和 MMP-13 蛋白水平與對照組比較分別下降 3.3 倍和 4.2 倍，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )，提示 SOX5 低表達抑制 MMPs 基因家族關(guān)鍵成員的表達。

討 論

目前，OA 的發(fā)病機制機制尚不清楚，缺乏有效的臨床治療藥物。因此，尋找和研發(fā)特異性有效治療 OA 的靶向藥物迫在眉睫。最新研究發(fā)現(xiàn) SOX5在 OA 患者滑膜組織、骨關(guān)節(jié)液中高表達，下調(diào)SOX5 的表達明顯改善軟骨破壞程度[5]，提示 SOX5是治療 OA 潛在的靶點，但 SOX5 在 OA 軟骨細胞中的生物學功能仍不清楚。

外傷、機械應力及炎癥反應等因素激活軟骨細胞釋放腫瘤壞死因子 α ( TNF-α ) 和 IL-1β 引起炎癥反應[6]。大量研究證實，炎癥因子在 OA 早期病理性改變中具有重要作用，IL-1β 通過誘導炎癥的產(chǎn)生，聯(lián)合其它炎癥因子對關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn) SOX5 在 OA 細胞中高表達；有趣的是，下調(diào) SOX5 的表達顯著抑制 IL-6 和IL-1β mRNA 的表達水平，提示抑制 SOX5 表達能緩減 OA 炎癥反應。為了進一步證實這一結(jié)論，本研究檢測了正常培養(yǎng)的 OA 細胞上清中 IL-6 和 IL-1β的含量，發(fā)現(xiàn) SOX5 低表達 OA 細胞中 IL-6 和 IL-1β濃度顯著低于對照組，提示下調(diào) SOX5 的表達能抑制 IL-6 和 IL-1β 的合成和釋放進而改善炎癥反應。

本研究結(jié)果表明，OA 主要特征為關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡和細胞外基質(zhì)的降解，細胞外基質(zhì)主要由蛋白聚糖、膠原和非膠原蛋白等構(gòu)成?；|(zhì)金屬蛋白酶 ( MMP )、蛋白聚糖酶 ( ADAMTS ) 是主要降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞和滑膜細胞分泌的 MMP-3 可以降解絕大多數(shù)的基質(zhì)蛋白和膠原蛋白，從而損傷關(guān)節(jié)軟骨[12-13]；另外，MMP-3 可以激活其它的基質(zhì)金屬蛋白酶 ( 如MMP-1、MMP-9、MMP-13 )，進一步加重對細胞外基質(zhì)的降解促進 OA 的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，COL2A1 和 ACAN 在 OA 軟骨細胞中低表達，而MMP-1 和 MMP-13 高表達，下調(diào) SOX5 表達明顯增高 COL2A1 和 ACAN 的 mRNA 水平，減少 MMP-1 和MMP-13 蛋白表達。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中惟一存在的細胞成分，負責合成與分泌細胞外基質(zhì)[14-16]；蛋白聚糖通過保持基質(zhì)中的水分來維持組織結(jié)構(gòu)的完整[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在 OA 病變過程中，軟骨細胞出現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)，認為軟骨細胞凋亡在關(guān)節(jié)退行性改變的過程中發(fā)揮著重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示 OA 軟骨細胞凋亡率為 18.35%，表明 OA 病理性改變時軟骨細胞發(fā)生凋亡；本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào) SOX5的表達后軟骨細胞凋亡率顯著降低，提示下調(diào) SOX5可能通過抑制 OA 細胞凋亡從而保護軟骨細胞；還提示下調(diào) SOX5 表達可能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，進而促進細胞外基質(zhì)的合成與分泌以及通過抑制細胞凋亡保護軟骨細胞破損，最終抑制 OA 的發(fā)展。

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Biological functions of transcription factor SOX5 in osteoarthritis cartilage cells

ZHANG Lei, NING Yu-hui, LI Guo-shun, HE Tao, MOU Zong-you, LI Ming, GUO Jin-quan. Department of Joint Surgery, Dezhou People’s Hospital,Dezhou, Shangdong, 253000, China

HE Tao, Email: dzrmyyhetao@163.com

ObjectiveTo investigate biological functions of transcription factor SOX5 in osteoarthritis cartilage cells.MethodsHuman osteoarthritic cartilage chondrocytes ( OA cartilage cells ) were isolated and cultured.OA cartilage cells were transfected with siSOX5 using lipidosome 2000 and named as OA-siSOX5 cells, while OA cartilage cells transfected with NCsiRNA served as negative control. Levels of SOX5, interleukin 6 ( IL-6 ), IL-1β,Collagen II ( COL2A1 ), protein polysaccharide ( ACAN ) mRNA expression in OA cartilage cells transfected with siSOX5 or NCsiRNA were detected using Real time PCR. Concentration of IL-6 and IL-1β in culture supernatants of OA cartilage cells transfected with siSOX5 or NCsiRNA were measured using ELISA. The levels of SOX5, matrix metalloproteinase 1 ( MMP-1 ) and MMP-13 protein expression were detected using Western blot and apoptosis was measured using AnnexinV-FITCI and flow cytometry.ResultsLevels of IL-6 ( 0.72 ± 0.05 ) and IL-1β mRNA( 0.64 ± 0.07 ) in OA-siSOX5 cells were significantly higher than OA-NCsiRNA cells ( 1.32 ± 0.08, 1.64 ± 0.09 )(P＜ 0.05 ), while the levels of COL2A1 ( 1.27 ± 0.08 ) and ACAN mRNA ( 2.38 ± 0.17 ), and the concentration IL-6( 175.2 ± 14.5 ) pg / ml and IL-1β ( 102.6 ± 20.3 ) pg / ml in OA-siSOX5 cells were notable lower compared with OANCsiRNA cells [ ( 584.6 ± 74.5 ) pg / ml, ( 268.4 ± 25.3 ) pg / ml;P＜ 0.05 ]. The levels of MMP-1 ( 0.53 ± 0.05 ) and MMP-13 protein ( 0.46 ± 0.08 ) in OA-siSOX5 cells were significantly lower than OA-NCsiRNA cells ( 1.95 ± 0.11,2.48 ± 0.24;P＜ 0.05 ).ConclusionsDown-expressed SOX5 could relieve the development of OA by inhibiting the expression of matrix metalloproteinase, apoptosis and inflammation, promoting synthesis and excretion of the extracellular matrix.

Osteoarthritis; Cartilage cells; SOX5; MMPs; Apoptosis

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.12.011

R684.3, Q291

253000 山東，德州人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科

何濤，Email: dzrmyyhetao@163.com

2017-08-31 )

李貴存 )