盧正珂,史鋒, 2*

1(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

過表達(dá)mqo對重組谷氨酸棒桿菌L-異亮氨酸和4-羥基異亮氨酸合成的影響

盧正珂1,史鋒1, 2*

1(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)具有促進(jìn)胰島素分泌、降低胰島素抵抗活性功能，在治療糖尿病方面有潛在的應(yīng)用價值。在產(chǎn)L-異亮氨酸(L-isoleucine，Ile)的谷氨酸棒桿菌SN01菌株中過表達(dá)ido基因后可以合成4-HIL。為了促進(jìn)草酰乙酸的供應(yīng)和4-HIL合成，在這株重組菌中又過表達(dá)了mqo。發(fā)酵144 h后，ido-mqo過表達(dá)菌的4-HIL產(chǎn)量是(60.86±2.24)mmol/L，低于ido過表達(dá)菌(72.06±5.60)mmol/L；但是，Ile的積累量高達(dá)(101.39±2.20)mmol/L，顯著高于ido過表達(dá)菌(5.00±1.43)mmol/L。對ido-mqo過表達(dá)菌代謝途徑中部分關(guān)鍵基因的RT-PCR分析表明，進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流由異檸檬酸裂解酶分流，進(jìn)入乙醛酸循環(huán)，導(dǎo)致4-HIL合成所需的另一底物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)供應(yīng)不足和Ile過剩。于是添加α-KG，當(dāng)添加量為40 mmol/L時，4-HIL的產(chǎn)量提高到(77.7±10.91)mmol/L，Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率提高到75%。因此，過表達(dá)mqo能夠促進(jìn)Ile合成，添加α-KG后能夠促進(jìn)Ile向4-HIL轉(zhuǎn)化，從而提高4-HIL產(chǎn)量。

4-羥基異亮氨酸；谷氨酸棒桿菌SN01；L-異亮氨酸；mqo；α-酮戊二酸

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，從1980年到2014年，糖尿病患者人數(shù)由1.08億增加到4.22億[1]，其中II型糖尿病患者人數(shù)最多。研究表明，葫蘆巴種子可用于臨床治療II型糖尿病[2-3]，這其中起關(guān)鍵作用的生物活性物質(zhì)是(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)[4]，它具有促進(jìn)胰島素分泌、降低胰島素抵抗作用[5]，因此4-HIL在治療II型糖尿病方面有潛在的應(yīng)用價值。

目前，4-HIL的制備方法主要有：葫蘆巴種子提取法、化學(xué)-酶合成法、酶合成法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法是適于工業(yè)生產(chǎn)4-HIL最簡單、有效和經(jīng)濟(jì)的方法。2009年，研究人員在蘇云金芽孢桿菌2e2 AKU 0251中發(fā)現(xiàn)了異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleucine dioxygenase，IDO)[6-8]。IDO催化L-異亮氨酸(L-isoleucine，Ile)發(fā)生4-羥化反應(yīng)，生成4-HIL，同時使α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)發(fā)生氧化反應(yīng)，生成琥珀酸，伴隨消耗氧氣并生成二氧化碳。隨后，SMIRNOV等通過在大腸桿菌(Escherichiacoli)中克隆表達(dá)IDO編碼基因ido，將外源添加的Ile轉(zhuǎn)化成了4-HIL[9]，但發(fā)酵中外源添加Ile會增加4-HIL的生產(chǎn)成本。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)SN01是1株工業(yè)用Ile生產(chǎn)菌，實驗室前期在SN01中克隆和表達(dá)來自蘇云金芽孢桿菌YBT 1520的ido基因，將SN01中自身合成的Ile成功轉(zhuǎn)化為4-HIL[10](圖1)，實現(xiàn)了4-HIL的一步從頭合成，搖瓶發(fā)酵144 h后4-HIL產(chǎn)量達(dá)到(65.44±2.27)mmol/L，Ile向4-HIL轉(zhuǎn)化率是85%。

圖1 重組谷氨酸棒桿菌中4-HIL的合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of 4-HIL in recombinant C.glutamicum

在谷氨酸棒桿菌中，草酰乙酸不僅是TCA循環(huán)中關(guān)鍵的中間物質(zhì)，也是IDO催化反應(yīng)的兩個底物α-KG和Ile的共同前體物質(zhì)，因此在4-HIL的合成途徑中，草酰乙酸的供應(yīng)很重要。本研究中，在外源表達(dá)ido的基礎(chǔ)上，構(gòu)建過表達(dá)蘋果酸：醌氧化還原酶(malate:quinone oxidoreductase，MQO)編碼基因mqo的重組菌，來增加草酰乙酸的供應(yīng)，探究重組菌搖瓶發(fā)酵中4-HIL產(chǎn)量的變化，為4-HIL的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

所用菌株包括大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌SN01，質(zhì)粒包括pJYW-4-ido[10]和pJYW-4-ido-mqo，均為本實驗室保藏。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

發(fā)酵種子培養(yǎng)基：用于發(fā)酵前期活化菌株培養(yǎng)，含有24.0 g/L葡萄糖，0.4 g/L (NH4)2SO4，1.25 g/L尿素，40.0 g/L玉米漿，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4，pH 7.2。滅菌條件為121 ℃，15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，含有140.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L (NH4)2SO4，10.0 g/L玉米漿，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4，0.5 g/L FeSO4，20 g/L CaCO3，pH 7.2；需要時添加20、30或40 mmol/L α-KG。滅菌條件為115 ℃，15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌的搖瓶發(fā)酵

谷氨酸棒桿菌的搖瓶發(fā)酵主要參照方慧敏[11]的操作，其中種子培養(yǎng)基置于回旋式搖床30 ℃、150 r/min培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基置于回旋式搖床30 ℃、200 r/min培養(yǎng)。每隔12 h取1次樣，測定菌體濃度、殘?zhí)?、氨基酸含量和?KG含量等。

1.2.1.1 氨基酸含量的測定

測定胞內(nèi)外氨基酸含量時發(fā)酵樣品的處理方法參照文獻(xiàn)[12]，之后用HPLC測定氨基酸含量[13]。在計算胞內(nèi)氨基酸含量時首先計算出DCW (g/L) =0.34×OD562，然后再根據(jù)1 g DCW = 1.6 mL的公式計算得出胞內(nèi)體積[14]，最后得出胞內(nèi)氨基酸的實際含量。

1.2.1.2 α-KG含量的測定

胞內(nèi)α-KG含量測定方法參照牛騰飛[15]的操作。測定胞外α-KG含量時樣品的處理方法是，首先將發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm孔徑的水相針式濾膜過濾后，再進(jìn)行后續(xù)HPLC操作測定α-KG含量。胞內(nèi)外α-KG的計算方法參照胞內(nèi)外氨基酸的計算方法。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)錄水平分析

利用RNA反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR分析菌株中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平。取48 h的發(fā)酵液200 μL，12 000 r/min離心3 min，沉淀用100 mg/mL的溶菌酶于37 ℃處理30 min，后續(xù)具體操作參照RNA提取試劑盒說明書、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。反應(yīng)以16S rRNA作為內(nèi)參進(jìn)行校正，通過Ct值來比較基因轉(zhuǎn)錄水平差異，最終通過計算2-ΔΔCt來獲得目的基因相對于對照菌株的轉(zhuǎn)錄水平[16]，數(shù)值>1為上調(diào)，<1則為下調(diào)。

2 結(jié)果與分析

在谷氨酸棒桿菌中，依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和脂質(zhì)的膜結(jié)合蛋白MQO[17]不僅能催化蘋果酸回補(bǔ)草酰乙酸，還能加快TCA循環(huán)的下游途徑，因此在本文中，構(gòu)建了過表達(dá)mqo的重組菌，并分析重組菌中4-HIL產(chǎn)量的變化。

2.1 構(gòu)建質(zhì)粒pJYW-4-ido-mqo

以SN01基因組為模板，用引物mqo-F(5’-CAAGGATCCAGAAGGAGATATTGCATGTCAGATTC-C-C-CGAAG-3’)和mqo-R(5’-TATGTCGACTTAGGCTTCCTCAAGCTTCAGG-3’)PCR擴(kuò)增基因片段BamHI-mqo-SalI，連接到質(zhì)粒pJYW-4-ido上，獲得重組質(zhì)粒pJYW-4-ido-mqo。質(zhì)粒pJYW-4-ido-mqo的PCR驗證和酶切驗證結(jié)果見圖2。pJYW-4-ido-mqo全長9 260 bp。

圖2 質(zhì)粒pJYW-4-ido-mqo的PCR驗證和酶切驗證圖Fig.2 Verification of plasmid pJYW-4-ido-mqo by PCR and restriction enzyme digestion

1號泳道是用引物mqo-F/mqo-R PCR驗證質(zhì)粒的結(jié)果，擴(kuò)增片段預(yù)計大小是1503 bp，實際驗證正確；2號泳道是用BamHI/SalI酶切質(zhì)粒驗證，酶切后片段預(yù)計大小分別是1 524 bp和7 736 bp，實際驗證正確。驗證結(jié)果表明，質(zhì)粒pJYW-4-ido-mqo構(gòu)建成功。

再將質(zhì)粒pJYW-4-ido-mqo電轉(zhuǎn)入SN01感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗證，將驗證正確的重組菌命名為SN01/pJYW-4-ido-mqo(以下簡稱SZ05)。

2.2 過表達(dá)mqo對菌株生長狀況的影響

通過搖瓶發(fā)酵對mqo過表達(dá)菌株SZ05生長情況進(jìn)行考察，圖3顯示搖瓶發(fā)酵過程中，菌株SN01/pJYW-4-ido(以下簡稱SZ01)和SZ05的OD562和殘?zhí)亲兓? h～132 h，菌株SZ05的OD562低于菌株SZ01(圖3a)，在發(fā)酵末期144 h，SZ05的菌體濃度稍高于SZ01。0～12 h，2株菌的耗糖率相同(圖3b)，12 h后，菌株SZ05的殘?zhí)橇恳恢备哂赟Z01，到發(fā)酵結(jié)束，SZ01的糖耗盡，SZ05剩余14.50 g/L葡萄糖。由此可見mqo過表達(dá)影響菌株的生長狀況。據(jù)文獻(xiàn)報道，TCA循環(huán)減弱不利于菌株生長[18]，因此，菌株SZ05生長變慢可能是由于TCA循環(huán)碳流減弱所致。TCA循環(huán)碳流減弱原因會進(jìn)一步分析。

圖3 SZ01和SZ05搖瓶發(fā)酵過程的菌濃(a)和殘?zhí)?b)Fig.3 Biomass (a) and residual glucose (b) of SZ01 and SZ05 strains in shake flask cultivation

2.3 過表達(dá)mqo對菌株發(fā)酵氨基酸產(chǎn)量的影響

通過搖瓶發(fā)酵對菌株SZ05產(chǎn)4-HIL的能力進(jìn)行考察，圖4顯示搖瓶發(fā)酵過程中，菌株SZ01和SZ05中氨基酸產(chǎn)量的變化。發(fā)酵前60 h，ido單表達(dá)菌SZ01快速積累4-HIL(圖4a)，60 h后4-HIL的積累速度變慢，Ile在36 h時積累量最高(圖4b)，隨后伴隨著4-HIL的不斷生成，Ile濃度逐漸降低。發(fā)酵全程中，ido-mqo共表達(dá)菌SZ05中4-HIL的產(chǎn)量逐漸升高，但產(chǎn)量一直低于SZ01，Ile的積累量也逐漸升高，沒有降低。發(fā)酵144 h后，SZ01積累(72.06±5.60)mmol/L的4-HIL，剩余(5.00±1.43)mmol/L的Ile，Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率是94%；而SZ05合成(60.86±2.24)mmol/L的4-HIL，產(chǎn)量稍低于SZ01，但剩余(101.39±2.20)mmol/L的Ile，Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率只有38%。發(fā)酵144 h后，SZ05中天冬氨酸族氨基酸總產(chǎn)量是(205.76±5.30)mmol/L(圖4c)，顯著高于SZ01中天冬氨酸族氨基酸總產(chǎn)量(115.58±8.11)mmol/L，且發(fā)酵液中L-谷氨酸(Glu)和L-蘇氨酸(Thr)含量明顯降低(圖4d)，L-丙氨酸(Ala)含量降低不明顯，L-甘氨酸(Gly)和L-賴氨酸(Lys)含量增加，但副產(chǎn)物總量降低。綜上說明，過表達(dá)mqo增加了天冬氨酸族氨基酸的產(chǎn)量，但降低了Ile向4-HIL的轉(zhuǎn)化率。

圖4 菌株SZ01和SZ05發(fā)酵氨基酸產(chǎn)量的差異Fig.4 Amino acids production of SZ01 and SZ05

有研究表明，在谷氨酸棒桿菌AHP-3中，敲除mqo后減少了TCA循環(huán)的代謝流，增加了草酰乙酸到Lys合成的碳流，提高了Lys的產(chǎn)量[19]。而在本研究中，過表達(dá)mqo的菌株出現(xiàn)生長速率下降和Lys積累量增加的現(xiàn)象，且天冬氨酸族氨基酸的產(chǎn)量顯著提高，猜測可能是由于更多的碳流流入天冬氨酸族氨基酸合成途徑，減弱了TCA循環(huán)，于是對SZ05中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。

2.4 過表達(dá)mqo的菌株中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平變化

根據(jù)代謝途徑分析表明，過表達(dá)mqo回補(bǔ)的草酰乙酸可分別進(jìn)入天冬氨酸族氨基酸合成途徑和TCA循環(huán)。針對菌株SZ05中天冬氨酸族氨基酸的產(chǎn)量顯著提高的結(jié)果，對菌株SZ01和SZ05代謝途徑中的關(guān)鍵基因(天冬氨酸激酶基因lysC、異檸檬酸裂解酶基因aceA、檸檬酸合酶基因gltA、琥珀酸脫氫酶基因sdhA、異檸檬酸脫氫酶基因icd、α-酮戊二酸脫氫酶基因odhA和ido)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析(圖5)。

圖5 菌株SZ01和SZ05中主要基因的轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果Fig.5 The transcription level of target genes

與SZ01相比，SZ05中l(wèi)ysC、aceA、gltA和sdhA的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，icd的轉(zhuǎn)錄水平基本無變化，而odhA和ido的轉(zhuǎn)錄水平稍有降低。這說明過表達(dá)mqo有利于加強(qiáng)進(jìn)入天冬氨酸族氨基酸合成途徑和TCA循環(huán)的碳流，但由于aceA和sdhA的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，使得進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流由異檸檬酸裂解酶分流，進(jìn)入乙醛酸循環(huán)，很可能造成IDO酶促反應(yīng)中底物α-KG供應(yīng)不足，導(dǎo)致Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率降低，從而導(dǎo)致Ile過剩。

研究表明，TCA循環(huán)和天冬氨酸族氨基酸合成途徑中碳流分布不均勻會影響菌株生長和產(chǎn)物產(chǎn)量，TCA循環(huán)減弱會導(dǎo)致菌株生長變慢[18]。因此，在菌株SZ05中，由于基因lysC和aceA的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，使得天冬氨酸族氨基酸合成途徑中的碳流增加，TCA循環(huán)碳流減少，從而導(dǎo)致菌株SZ05生長變慢。

2.5 過表達(dá)mqo后α-KG含量和胞內(nèi)氨基酸含量的變化

針對過表達(dá)mqo后Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率低和Ile過剩的問題，進(jìn)一步測定了胞內(nèi)外的α-KG含量。在菌株SZ05中，發(fā)酵48 h胞內(nèi)α-KG的含量(0.61 mmol/L)低于SZ01胞內(nèi)α-KG含量(1.13 mmol/L)(圖6a)，發(fā)酵液中α-KG含量(0.81 mmol/L)也明顯低于菌株SZ01發(fā)酵液中α-KG含量(3.67 mmol/L)，由此說明，過表達(dá)mqo導(dǎo)致底物α-KG供應(yīng)量降低。

另外，IDO酶促反應(yīng)會受到過量底物Ile的抑制作用[12, 20]，當(dāng)Ile濃度在0～10 mmol/L時，IDO的酶活隨底物的增加而提高，當(dāng)Ile高于20 mmol/L時，IDO的活性受到抑制。IDO是一種胞內(nèi)蛋白，在胞內(nèi)起催化反應(yīng)，胞內(nèi)Ile的過多積累會抑制IDO酶活。為此進(jìn)一步測定了60、84和108 h的胞內(nèi)Ile含量(圖6b)，菌株SZ05中胞內(nèi)Ile含量(108.13～125.34 mmol/L)顯著高于菌株SZ01中Ile含量(49.12～11.25 mmol/L)，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，SZ01中Ile的積累量是降低的，而SZ05的積累量一直在升高，并顯著高于20 mmol/L。所以Ile過多過快的積累也影響了SZ05中IDO的活性，從而降低了Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率。

圖6 菌株SZ01和SZ05中α-KG含量和胞內(nèi)氨基酸含量的測定結(jié)果Fig.6 (a) Intracellular (I) and extracellular (E) concentrations of α-KG at 48 h, (b) intracellular concentrations of 4-HIL and Ile at 60 h, 84 h and 108 h

2.6 添加α-KG對4-HIL產(chǎn)量的影響

由于SZ05中α-KG的供應(yīng)量明顯不足，導(dǎo)致Ile過剩。因此，進(jìn)一步研究了添加不同濃度的α-KG對合成4-HIL的影響(圖7)。添加20、30和40 mmol/L的α-KG后，菌株SZ05在發(fā)酵144 h后，Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率分別提高到70%、81%和75%，4-HIL的產(chǎn)量均比不添加α-KG時高，當(dāng)添加40 mmol/L的α-KG時，4-HIL的產(chǎn)量提高到(77.7±10.91)mmol/L。因此，在菌株SZ05發(fā)酵中添加α-KG有利于提高4-HIL的產(chǎn)量，提高Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率。

圖7 α-KG的添加濃度對4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of addition of α-KG on 4-HIL production

3 結(jié)論

過表達(dá)mqo后，過多積累了Ile和天冬氨酸族氨基酸的含量，不利于Ile向4-HIL的轉(zhuǎn)化，降低了4-HIL的產(chǎn)量。通過對mqo過表達(dá)菌株的代謝途徑中部分關(guān)鍵基因的RT-PCR分析表明，進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流由異檸檬酸裂解酶分流，進(jìn)入乙醛酸循環(huán)，導(dǎo)致IDO酶促反應(yīng)中另一底物α-KG供應(yīng)不足和菌株生長變慢，出現(xiàn)Ile過剩的結(jié)果。另外，胞內(nèi)Ile的過多過快的積累也會影響mqo過表達(dá)菌株中IDO的活性，從而降低了Ile到4-HIL的轉(zhuǎn)化率。隨后，通過外源添加α-KG提高了重組菌中4-HIL的產(chǎn)量。在后期的研究中可以通過代謝工程改造敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA加強(qiáng)TCA循環(huán)提高α-KG的供應(yīng)，進(jìn)一步提高4-HIL的產(chǎn)量。本研究為4-HIL的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要依據(jù)。

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EffectsofmqooverexpressiononthesynthesisofL-isoleucineand4-hydroxyisoleucineinrecombinantCorynebacteriumglutamicum

LU Zheng-ke1,SHI Feng1,2*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

4-hydroxyisoleucine (4-HIL), which can exhibit unique insulinotropic and insulin-sensitizing activities, has potential medical value in treating diabetes. AnL-isoleucine (Ile)-producer,Corynebacteriumglutamicumssp.lactofermentumSN01 can synthesize 4-HIL whenidogene. In order to promote the supply of oxaloacetate and synthesis of 4-HIL,mqowas overexpressed in this recombinant strain. After 144 h of fermentation, 4-HIL production of ido-mqo-expressing strain was (60.86±2.24) mmol/L, lower than that ofido-expressing strain (72.06±5.60) mmol/L. However, its Ile concentration was (101.39±2.20) mmol/L, significantly higher than that ofido-expressing strain (5.00±1.43) mmol/L. The RT-PCR analysis of some key genes in the metabolic pathway ofido-mqo-expressing strain showed that the carbon flow entering the TCA cycle was diverted by the isocitrate lyase to the glyoxylic acid cycle, resulting in the insufficient supply of another substrate for 4-HIL synthesis, i.e. α-ketoglutarate (α-KG) and excessive Ile concentration. Therefore, α-KG was added. When 40 mmol/L of α-KG was added, the yield of 4-HIL increased to (77.7±10.91) mmol/L and the conversion ratio of Ile to 4-HIL increased to 75%. Therefore, overexpression ofmqocan promote Ile synthesis, and addition of α-KG can promote the conversion of Ile to 4-HIL, thereby increasing the yield of 4-HIL.

4-hydroxyisoleucine;Corynebacteriumglutamicumssp.lactofermentumSN01;L-isoleucine;mqo;α-ketoglutarate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014845

碩士研究生(史鋒副教授為通訊作者,E-mail: shifeng@jiangnan.edu.cn)。

江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索資助課題(編號SKLF-ZZB-201405)

2017-05-28，改回日期：2017-06-25