周 蕾，井樂剛，周 琳 ，王柏鳳，馮樹丹 *，宋新元

轉(zhuǎn)基因水稻葉片殘體對白符跳和赤子愛勝蚓的影響

周 蕾1，井樂剛1，周 琳1，王柏鳳2，3，馮樹丹1*，宋新元2，3

（1.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150025；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，長春 130033；3.吉林省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，長春 130033）

為研究轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5對土壤中非靶標生物安全性的影響，以轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5的非轉(zhuǎn)基因親本品種吉粳88為對照，選擇白符跳和赤子愛勝蚓作為指示生物，在室內(nèi)條件下，用水稻1c-5的葉片喂飼白符跳和赤子愛勝蚓，考察其對白符跳存活率和體長的影響，以及對赤子愛勝蚓存活率、繁殖率和體重變化率的影響。結(jié)果表明，與吉粳88相比，水稻1c-5對白符跳和赤子愛勝蚓無顯著影響。由此可初步判定，短期內(nèi)轉(zhuǎn)Cry1c基因水稻1c-5對白符跳和赤子愛勝蚓無生態(tài)風險。

轉(zhuǎn)基因水稻；白符跳；赤子愛勝蚓；存活率；繁殖率

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物，如何培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的水稻品種對世界糧食生產(chǎn)具有重要意義[1]。20世紀80年代，轉(zhuǎn)基因技術被應用于水稻優(yōu)化育種研究[2]，迄今已有大量的相關研究報道[3-5]。我國在世界轉(zhuǎn)基因水稻研究方面具有重要地位，已成功獲得一大批具有重要應用價值和自主知識產(chǎn)權的基因，并培育出抗蟲、抗除草劑、抗病、營養(yǎng)高效、耐鹽和高產(chǎn)等一系列轉(zhuǎn)基因水稻品系/組合，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻研究處于世界領先水平[6]。由于水稻在我國食物結(jié)構中的重要性和水稻起源的特殊地位，在研發(fā)轉(zhuǎn)基因水稻的同時，其安全性問題亦成為被關注的焦點[7]。

目前，轉(zhuǎn)基因水稻的環(huán)境風險研究，主要集中在轉(zhuǎn)基因水稻外源基因漂移及影響[8-9]、轉(zhuǎn)基因水稻對生物多樣性的影響等。其中，對生物多樣性的影響研究分為地上與地下兩部分，地上部多以物種群落結(jié)構參數(shù)為評價指標[10-11]，地下部多以土壤動物群落、微生物群落結(jié)構參數(shù)為評價指標[12-13]。祝向鈺等[14]研究了轉(zhuǎn)Bt水稻土壤跳蟲群落組成及其數(shù)量變化，研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt水稻種植會導致土壤跳蟲個別稀有類群的消失，并顯著影響半土生和真土生類群以及土壤跳蟲總量，但對群落多樣性、均勻度和種類豐富度等無顯著影響。由于田間調(diào)查數(shù)據(jù)的評價方法很容易受環(huán)境因子等影響，實驗周期較長、重復性較差，近年來采用室內(nèi)生測方法，利用常見環(huán)境生物的指示作用，成為研究轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全性的重要補充手段[15]。Zwahlen等[16]分別用轉(zhuǎn)基因玉米葉片和非轉(zhuǎn)基因玉米葉片喂飼蚯蚓，結(jié)果表明，用轉(zhuǎn)基因玉米葉片喂飼的蚯蚓體重增加4.4%，而用非轉(zhuǎn)基因玉米葉片喂飼的蚯蚓體重下降18.3%。

土壤動物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，特別是土壤中廣泛存在的跳蟲和蚯蚓。跳蟲屬于彈尾綱、彈尾目，其種類和個體數(shù)量在土壤中十分豐富，是土壤中的重要分解者[17]，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中能夠參與物質(zhì)循環(huán)、提高土壤肥力等活動，在土壤質(zhì)量評價、污染監(jiān)測、污染土壤的生物修復以及控制植物真菌病害等方面都具有重要作用[18]。白符跳（Folsomia candida）作為對化學物質(zhì)最為敏感的跳蟲之一，具有抗旱、抗凍、抗缺氧、孤雌生殖、對毒物敏感等特性，是國內(nèi)外土壤生態(tài)安全評價中普遍使用的模式物種[19]。蚯蚓約占土壤生物總量的60%～80%，其生存活動可促進有機質(zhì)的分解、促進土壤養(yǎng)分的循環(huán)與釋放、改善土壤結(jié)構和理化性狀[20]，在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能中起著不可替代的作用[21]。赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）對毒物敏感、體型較大，且具有標準的急毒性和亞毒性測定方法[22]，常被作為生態(tài)毒理試驗的標準物種。

本研究選擇轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8的葉片，以常用的環(huán)境指示生物白符跳和赤子愛勝蚓作為評價物種，在室內(nèi)可控條件下，采用直接喂飼法，研究了轉(zhuǎn)基因水稻葉片殘體對白符跳存活率和體長的影響，以及對赤子愛勝蚓存活率、繁殖率和體重變化率的影響，旨在為評估轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供參考，為轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5的安全性評價提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用轉(zhuǎn)基因水稻為我國自主研制的轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5及其非轉(zhuǎn)基因親本對照吉粳88，均由轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)單位吉林省農(nóng)業(yè)科學院提供。

本試驗所用跳蟲為白符跳，蚯蚓為赤子愛勝蚓大平2號，二者均取自國家轉(zhuǎn)基因玉米、大豆中試與產(chǎn)業(yè)化基地（吉林省公主嶺）、吉林省農(nóng)業(yè)科學院轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全研究課題組培養(yǎng)的試驗種群，試驗時該種群已在實驗室內(nèi)穩(wěn)定培養(yǎng)3年。

本試驗所用土壤為東北黑土，取自吉林省農(nóng)業(yè)科學院公主嶺院區(qū)，質(zhì)地為壤土，采土區(qū)土地未種植過任何轉(zhuǎn)基因作物。

1.2 試驗方法

1.2.1 白符跳室內(nèi)生測

取水稻成熟期葉片，60℃烘干12 h，用植物組織粉碎機破碎后，置于-20℃冰箱備用[23]。按石膏∶活性炭=9∶1（體積）的比例配制培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)皿中，收集3 d內(nèi)白符跳所產(chǎn)卵塊放入其中，將培養(yǎng)盒放置到人工氣候箱內(nèi)進行白符跳的卵化及“同步化”培養(yǎng)。氣候箱內(nèi)溫度為20±1℃，光周期為全黑夜，每周用去離子水調(diào)節(jié)1次空氣相對濕度，使其接近100%。“同步化”培養(yǎng)時，在培養(yǎng)皿中添加啤酒酵母作為食物[24]。從“同步化”培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中選取蟲齡為10～12 d的白符跳進行喂飼試驗，喂飼試驗環(huán)境與“同步化”培養(yǎng)的試驗環(huán)境相同。喂飼試驗中，以上述粉碎后的轉(zhuǎn)基因水稻葉片作為食物，每2 d檢查1次并更換食物。以喂飼轉(zhuǎn)基因水稻葉片的白符跳作為試驗組，以喂飼非轉(zhuǎn)基因水稻葉片的白符跳作為對照組，分別設置5個重復，每個重復內(nèi)放入10頭長勢基本一致的白符跳。分別在接蟲后第10、20、30 d對白符跳存活率進行調(diào)查，然后將培養(yǎng)皿放回恒溫氣候箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，試驗結(jié)束時從中隨機選取3頭白符跳，測量其體長并計算平均值。

1.2.2 赤子愛勝蚓室內(nèi)生測

分別取轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8的成熟期葉片，用蒸餾水洗凈后自然風干，人工粉碎，過孔徑為2.0 mm的篩。采集土層深度為5～25 cm未種植過轉(zhuǎn)基因作物的土壤，自然條件下風干后，用孔徑為15.0 mm的篩去除植物殘渣、沙石等，再過孔徑為2.0 mm篩[25]。將牛糞自然風干后打碎，過孔徑為2.0 mm篩。按照土壤∶牛糞∶葉片的質(zhì)量比為50∶5∶2的比例，將三者充分混合后，置于培養(yǎng)盒中[25-27]。挑選出生2個月、具有生殖環(huán)、長勢一致、體重180～220 mg的赤子愛勝蚓放入培養(yǎng)盒中。以用轉(zhuǎn)基因水稻葉片培養(yǎng)的赤子愛勝蚓為試驗組，用非轉(zhuǎn)基因水稻葉片培養(yǎng)的為對照組，各設置5組，每組中含赤子愛勝蚓10條。在24±1℃、空氣相對濕度65%、無光條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)盒頂端覆蓋紗布，并用軟膠套或細繩固定，以防蚯蚓逃脫并保證其呼吸通暢。分別在接蟲后第 7、14、21、28、35、42 d 調(diào)查存活成蚓數(shù)量。將各培養(yǎng)盒中存活的的赤子愛勝蚓全部取出，于室溫下用無菌水洗滌，濾紙干燥，稱重，記錄各培養(yǎng)盒中幼蚓及蚓繭的數(shù)量。按下式計算體重變化率：體重變化率=（成蚓檢查當天質(zhì)量-成蚓初始質(zhì)量）/成蚓初始質(zhì)量×100%。按下式計算繁殖率：繁殖率=檢查當天幼蚓數(shù)/初始幼蚓數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，用一般線性模型（General linear model）中的重復測量（Repeated measures）對測量數(shù)據(jù)進行方差分析，通過球形檢驗（Mauchly′s test of sphericity）判斷數(shù)據(jù)之間是否存在相關性。如果P＞0.05，說明數(shù)據(jù)之間不存在相關性，用單因素方差分析；如果p＜0.05，說明數(shù)據(jù)之間存在相關性，用多元方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對白符跳存活率與體長的影響

2.1.1 存活率

用轉(zhuǎn)基因水稻1c-5的葉片喂飼白符跳10、20、30 d后，其存活率分別為98%、96%和94%，均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8喂飼的白符跳存活率。方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻1c-5與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8相比，對白符跳的存活率無顯著影響（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)基因水稻對白符跳存活率的影響Figure 1 Effects of transgenic rice on survival rate of F.candida

2.1.2 體長

試驗條件下喂飼白符跳30 d后，每個重復中隨機選取3頭白符跳測量其體長，取平均數(shù)并進行單因素方差分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻1c-5和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8喂飼的白符跳體長均值均為1.17±0.01 mm（平均值±標準誤）。方差分析結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8相比，轉(zhuǎn)基因水稻1c-5對白符跳的體長無顯著影響（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻對白符跳體長的影響Figure 2 Effects of transgenic rice on body length of F.candida

2.2 對赤子愛勝蚓存活率、繁殖率及體重變化率的影響

2.2.1 存活率

試驗表明，無論是用轉(zhuǎn)基因水稻1c-5的葉片喂飼，還是用非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8的葉片喂飼，赤子愛勝蚓的存活率均隨著處理時間延長而不斷降低。在第7、14 d時，喂飼轉(zhuǎn)基因水稻1c-5蚯蚓的存活率，與喂飼非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8的基本一致；在第21、28、35、42 d時，與后者相比，前者的下降較慢。方差分析結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8相比，轉(zhuǎn)基因水稻1c-5對赤子愛勝蚓的存活率無顯著影響（圖3）。

2.2.2 繁殖率

圖3 轉(zhuǎn)基因水稻對赤子愛勝蚓存活率的影響Figure 3 Effects of transgenic rice on survival rate of E.fetida

用轉(zhuǎn)基因水稻1c-5和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8喂飼的赤子愛勝蚓，第7 d時均未繁殖，第14 d時均開始繁殖，繁殖高峰期均出現(xiàn)在第28 d。雖然轉(zhuǎn)基因水稻1c-5和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8的各組間增長數(shù)量不同，但方差分析結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8相比，轉(zhuǎn)基因水稻1c-5對赤子愛勝蚓的繁殖率無顯著影響（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因水稻對赤子愛勝蚓繁殖率的影響Figure 4 Effects of transgenic rice on reproductive rate of E.fetida

2.2.3 體重變化率

從表1可看出，用轉(zhuǎn)基因水稻1c-5與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8喂飼的赤子愛勝蚓，每7 d的體重變化率無顯著差異（P＞0.05）；從第28 d開始，各處理組中赤子愛勝蚓的體重開始下降，體重變化率為負值。方差分析結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?8相比，轉(zhuǎn)基因水稻1c-5對赤子愛勝蚓的體重變化率無顯著影響。

3 討論

1999年，關于轉(zhuǎn)基因玉米花粉對帝王蝶的影響被報道后[28]，轉(zhuǎn)基因作物對非靶標生物的影響引起了研究人員的廣泛關注。此外，研究人員還對如何選取具有代表性的種群作為非靶標效應的評價種群進行了激烈的討論。白符跳與赤子愛勝蚓均處于食物鏈底端，分布較廣，主要取食土壤內(nèi)的植物殘體，常被研究人員選作測試各種土壤污染物毒理性的模式生物。Yang 等[29]分別按 300 μg·g-1Cry1C 蛋白、600 μg·g-1Cry2A蛋白的比例，將上述兩種蛋白與啤酒酵母混合并喂飼白符跳，結(jié)果表明對白符跳的存活率無顯著影響。本研究結(jié)果與上述研究的結(jié)果是一致的。除此之外，也有研究表明，轉(zhuǎn)Bt作物不會對跳蟲產(chǎn)生影響。Bitzer等[30]在4個地區(qū)研究了轉(zhuǎn)Bt玉米與殺蟲劑對土壤表面跳蟲和地下跳蟲的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)Bt玉米對跳蟲的豐度無影響，對跳蟲物種多樣性指數(shù)的影響也較小。肖能文等[31]通過將不同濃度的Cry1Ac殺蟲蛋白加入試驗土壤處理赤子愛勝蚓，研究表明CrylAc殺蟲蛋白對蚯蚓存活率、體重變化及體內(nèi)總蛋白酶、過氧化氫酶、乙酰膽酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、纖維素酶活性均沒有不利影響。丁帥等[32]和冷春龍等[33]研究了轉(zhuǎn)基因棉花對赤子愛勝蚓的影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花與非轉(zhuǎn)基因棉花對赤子愛勝蚓體重變化的影響趨勢基本一致，蚓繭數(shù)、新產(chǎn)生的幼蚓數(shù)及體內(nèi)SOD活性均無顯著差異。Ahmad等[34]在土壤中添加轉(zhuǎn)Cry3Bb1基因玉米植株殘體，發(fā)現(xiàn)其對普通蚯蚓的生存和體重沒有顯著影響。Vercesi等[35]選用歐洲地區(qū)大面積種植的表達Cry1Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米葉，將其研成細粉，按不同劑量與土壤混合，沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米組織在降解過程中對蚯蚓的存活、生長和繁殖產(chǎn)生影響。進一步的研究表明陸生蚯蚓（Lumbricus terrestris）和內(nèi)棲蚯蚓（Aporrectodea caliginosa）2種蚯蚓可加快土壤中轉(zhuǎn)Cry1Ab基因玉米殘體的降解[36]。為了在田間較大面積中研究多年連續(xù)種植轉(zhuǎn)Bt基因玉米對蚯蚓的影響，Zeilinger等[37]在0.16 hm2土地上連續(xù)4年種植2種轉(zhuǎn)Bt基因玉米（Cry1Ab和Cry3Bb1），同時設置非轉(zhuǎn)基因玉米對照區(qū)，所有玉米收獲后均秸稈還田。在試驗區(qū)域的土壤中有4種蚯蚓生存，分別按不同種類對蚯蚓的生物量進行測試。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，無論是幼年還是成年蚯蚓，在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米種植區(qū)的生物量均無顯著性差異，因此認為轉(zhuǎn)Bt基因玉米對蚯蚓的影響很小。Merwe等[38]進行的一項為期28 d的試驗表明，Cry1Ab蛋白對安德愛勝蚓（Eisenia andrei）的蚓繭量和繭孵化量沒有顯著影響。本研究結(jié)果與上述研究的結(jié)果是一致的。除此之外，肖能文等[31]、冷春龍等[33]、舒迎花等[39]還研究了Bt毒蛋白對赤子愛勝蚓酶活性的影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt基因玉米秸稈處理對赤子愛勝蚓總蛋白沒有抑制作用，對過氧化氫酶沒有誘導作用，但在短時間內(nèi)能誘導超氧化物歧化酶（SOD）活性。

表1 赤子愛勝蚓的體重變化率Table 1 Body weight change rate of Eisenia fetida

4 結(jié)論

（1）短期內(nèi)轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5對土壤中非靶標生物的安全性無顯著影響。

（2）為考察長期種植轉(zhuǎn)Cry1c基因抗蟲水稻1c-5對土壤中非靶標生物的安全性，在將來的研究中，應延長喂飼試驗周期，測定Cry1c蛋白在試驗動物體內(nèi)的殘留量，對代表性的分子毒理學指標進行評價分析。

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Effects of transgenic rice leaf residues on Folsomia candida and Eisenia fetida

ZHOU Lei1,JING Le-gang1,ZHOU Lin1,WANG Bai-feng2,3,FENG Shu-dan1*,SONG Xin-yuan2,3
（1.College of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Harbin 150025,China;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China;3.Jilin Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Changchun 130033,China）

In order to investigate the effects of transgenic Cry1c rice 1c-5 on the safety of nontarget soil organisms,Folsomia candida and Eisenia fetida were studied as environmental bio-indicators.Under indoor conditions,both organisms were fed with leaves of transgenic rice 1c-5 and nontransgenic rice Jigeng88 as a control during the entire growth period.During this period,the survival rate and body length of F.candida as well as the survival,reproduction,and weight change rates of E.fetida were investigated.The results showed that lc-5 had no significant effect on the growth of both organisms,as compared with that of the nontransgenic control.Thus,we concluded that the transgenic rice line 1c-5 did not pose an ecological risk to F.candida and E.fetida following short-term exposure.

transgenic rice;Folsomia candida;Eisenia fetida;survival rate;reproduction rate

X820.4

A

1672-2043（2017）10-1978-06

10.11654/jaes.2017-0424

周 蕾，井樂剛，周 琳，等.轉(zhuǎn)基因水稻葉片殘體對白符跳和赤子愛勝蚓的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（10）：1978-1983.

ZHOU Lei,JING Le-gang,ZHOU Lin,et al.Effects of transgenic rice leaf residues on Folsomia candida and Eisenia fetida[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（10）：1978-1983.

2017-03-23 錄用日期：2017-06-21

周 蕾（1992—），女，吉林德惠人，碩士研究生，從事轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全性研究。E-mail：zl987012@163.com

*通信作者：馮樹丹 E-mail：sdf6616@163.com

國家自然科學基金項目（31500345）；國家科技重大專項課題（2016ZX08011-003）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（31500345）；The National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China（2016ZX08011-003）