李立波，任曉冬，竇 森*

固態(tài)發(fā)酵中2種微生物降解玉米秸稈效果的對比研究

李立波1，任曉冬2，竇 森1*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長春 130118；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118）

為探究哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）這2種菌株在固態(tài)發(fā)酵條件下降解玉米秸稈的效果，通過25 d的室內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)對固態(tài)發(fā)酵中添加哈茨木霉和枯草芽孢桿菌后玉米秸稈的有機(jī)碳、纖維素、木質(zhì)素、纖維素酶活、木聚糖酶活以及β-葡萄糖苷酶活變化進(jìn)行對比研究。結(jié)果表明：發(fā)酵第10～16 d時(shí)，哈茨木霉和枯草芽孢桿菌處理的玉米秸稈分解速率、纖維素酶活、木聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活均達(dá)到最高，發(fā)酵25 d后，2種微生物處理的玉米秸稈分別累積降解了21.79%和20.12%，說明兩者的降解效果差異不大；與枯草芽孢桿菌處理相比，哈茨木霉處理的秸稈剩余量、有機(jī)碳含量、剩余秸稈有機(jī)碳總量分別降低了1.67%、0.26%和1.80%，秸稈纖維素降解率、秸稈木質(zhì)素降解率、纖維素酶活、木聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活分別升高了6.99%、6.54%、0.7 FPU·mL-1、0.04 IU·mL-1和9.26 IU·mL-1，說明添加哈茨木霉和枯草芽孢桿菌均可以降解秸稈，但兩者對玉米秸稈的降解效果差異不明顯。

固態(tài)發(fā)酵；玉米秸稈；哈茨木霉；枯草芽孢桿菌

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，玉米、水稻和小麥作為主要的糧食作物，每年大約產(chǎn)8×108t作物秸稈[1]，其中玉米秸稈大約占作物秸稈總量的33.4%，是東北地區(qū)常見的農(nóng)業(yè)固體廢棄物[2]。玉米秸稈相當(dāng)于玉米生產(chǎn)的副產(chǎn)品，由于沒有被合理的利用[3]，大部分玉米秸稈農(nóng)民都選擇堆積在田間地頭等待在自然條件下腐爛降解或者是直接在田間用火焚燒，而焚燒秸稈不僅會減少土壤表層有機(jī)質(zhì)，危害土壤墑情，還會引起環(huán)境污染，對人類健康產(chǎn)生危害[4-5]。

玉米秸稈中纖維素含量占25%～35%，半纖維素含量占20%～40%，木質(zhì)素含量占10%～25%[6]，三者相互纏繞包裹構(gòu)成了植物細(xì)胞壁，它們通過各種化學(xué)鍵連接，成為難降解物質(zhì)[7-8]。近年來，國內(nèi)外致力于研究利用一些物理、化學(xué)、生物技術(shù)來進(jìn)行預(yù)處理秸稈，從而達(dá)到高效利用的目的。物理預(yù)處理包括機(jī)械加工法和蒸汽爆破法，但其處理效果有限、成本較高，不符合實(shí)際應(yīng)用的要求；化學(xué)預(yù)處理包括酸預(yù)處理法和堿預(yù)處理法，但易對環(huán)境造成二次污染，不適合進(jìn)行推廣利用；生物預(yù)處理主要是通過微生物或者酶降解秸稈，作為一種簡單、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的方法，已經(jīng)成為秸稈預(yù)處理的研究新熱點(diǎn)[6，9]。

生物處理中，降解纖維素的微生物包括真菌、細(xì)菌和放線菌[10]，真菌如曲霉屬、青霉屬和木霉屬被廣泛研究，經(jīng)常被用來生產(chǎn)高品質(zhì)和高濃度的木質(zhì)纖維素酶[11-12]，哈茨木霉本身具有較好的纖維素酶活性，并且纖維素酶系組成較為理想，具有較高β-葡萄糖苷酶酶活和木糖苷酶酶活，之前的一些實(shí)驗(yàn)研究也表明哈茨木霉具有較高效的纖維素酶生產(chǎn)系統(tǒng)[13]。Castro Aline等[14]研究表明，使用絲狀真菌哈茨木霉IOC-3844對經(jīng)過預(yù)處理的甘蔗渣進(jìn)行液體深層發(fā)酵，72 h后產(chǎn)生的纖維素酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶酶活均達(dá)到最高。Nelson Libardi等[15]研究表明，哈茨木霉可利用生活污水作為底物來生產(chǎn)纖維素酶。Vanessa Alves等[16]研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌哈茨木霉IOC-3844在最優(yōu)條件下，42 h后纖維素酶和β-葡萄糖苷酶酶活最高，然后將生產(chǎn)的纖維素酶濃縮后去處理甘蔗渣，28 h后甘蔗渣可以水解約50%。細(xì)菌中枯草芽孢桿菌由于具有典型的芽孢結(jié)構(gòu)，抗逆性強(qiáng)，容易適應(yīng)外界的不利環(huán)境，可在比較苛刻的條件下存活，還具有培養(yǎng)周期短的特點(diǎn)，易于工業(yè)化生產(chǎn)，所以在工農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用。枯草芽孢桿菌是少量可分泌纖維素胞外酶的細(xì)菌之一，能夠產(chǎn)生包括纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多種酶系，王毅[17]研究表明，枯草芽孢桿菌是具有木質(zhì)纖維素降解能力較高的高溫菌。Amir Jalal等[18]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌生長溫度為10～40℃，并能生產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶。謝鳳行等[19]對枯草芽孢桿菌通過紫外誘變、化學(xué)誘變及復(fù)合誘變選育出10個(gè)高纖維素酶活的突變株。王堯悅等[20]分離出一株纖維素降解菌經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)粗酶液對麩皮的粗纖維降解率最高，對麥草秸稈的粗纖維降解率最低。本文就哈茨木霉和枯草芽孢桿菌降解玉米秸稈效果進(jìn)行對比，旨在研究兩者對玉米秸稈降解效果的差異。

1 材料與方法

1.1 供試菌種與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用的微生物是從秸稈還田1年后的鮮土中分離出來的，經(jīng)鑒定屬于哈茨木霉和枯草芽孢桿菌，具體參見劉艷麗[21]的鑒定結(jié)果。

將微生物接種在含有30 mL培養(yǎng)基制成的固體斜面上，其中哈茨木霉為PDD培養(yǎng)基、枯草芽孢桿菌為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放入28℃培養(yǎng)箱72 h，得到成熟菌絲，取2 mL無菌水加到接種微生物的試管中振蕩2 min，得到孢子液，將溶液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算濃度并稀釋，制成孢子濃度為1×107個(gè)·mL-1的孢子懸液，最后將菌液移至液體培養(yǎng)基中（哈茨木霉為PDD液體培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基），菌液與培養(yǎng)基比例為 1∶10，在溫度 30 ℃，轉(zhuǎn)速為 100 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)6 d，得到含有孢團(tuán)菌絲體的菌液。

PDD 培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g·L-1，煮沸 30 min并過濾、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1。

PDD 液體培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g·L-1，煮沸 30 min 并過濾、葡萄糖 20 g·L-1。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、氫氧化鈉 5 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨 10 g·L-1、氫氧化鈉 5 g·L-1。

1.2 供試有機(jī)物料

玉米秸稈取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，品種為中金368（北京金粒粒金種子有限公司），2015年4月末播種，10月初秋收。土壤類型為黑土，基本性質(zhì)為：秸稈有機(jī)碳 419.34 g·kg-1，全氮為 6.91 g·kg-1，全磷 7.7 g·kg-1，全鉀 4.5 g·kg-1，C/N 為 61。收獲后將整株玉米秸稈自然風(fēng)干后粉碎至0.5 cm備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用BIOTECH-30SS固體發(fā)酵罐（上海保興生物工程設(shè)備有限公司），容積為30 L，能夠自動攪拌、控制濕度和溫度。發(fā)酵罐設(shè)定參數(shù)：溫度30℃，濕度60%，轉(zhuǎn)速 6.0 r·min-1。

礦物鹽培養(yǎng)液（g·L-1）：尿素 4.2，硫酸銨 19.6，氯化鈣0.028，磷酸二氫鉀28，硫酸鎂4.2，硫酸亞鐵0.07，硫酸錳 0.021，硫酸鋅 0.019，氯化鈷 4.2，酵母膏7。pH=5。

將1.5 kg的秸稈粉末加入發(fā)酵罐中后進(jìn)行滅菌，待溫度下降至設(shè)定溫度后開始接菌和加入無菌無機(jī)礦物鹽培養(yǎng)液，其中菌液為600 mL，無機(jī)礦物鹽培養(yǎng)液為3.75 L，發(fā)酵罐開始運(yùn)行。

每隔24 h在發(fā)酵罐中不同位置重復(fù)取樣3次，并分別對樣品進(jìn)行測定分析，記作3次重復(fù)，試驗(yàn)連取25 d。未經(jīng)發(fā)酵的秸稈記作對照組（CK）。樣品放入玻璃樣品管中在-20℃條件下冷藏儲存。

1.4 分析測定方法

秸稈有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀容量法[22]。

秸稈纖維素和木質(zhì)素含量測定參考國際通用方法[23]。取兩個(gè)砂芯漏斗或砂芯坩堝，分別記作1號和2號，放入馬弗爐中575℃恒重4 h，分別稱其重量并記為W1和W2，放入干燥器中備用。稱取兩個(gè)烘干的秸稈樣品0.3 g，分別加入兩支玻璃試管中，向兩支試管里加入3 mL 72%H2SO4，用玻璃棒攪拌直至H2SO4與秸稈樣品充分混勻。將兩只試管放入30℃水浴鍋中保溫1 h，并用玻璃棒攪拌，10 min 1次，共6次，使秸稈與H2SO4充分接觸反應(yīng)。1 h后將試管取出，將試管中全部水解液和秸稈樣品殘?jiān)謩e倒入2個(gè)500 mL藍(lán)蓋試劑瓶中，然后向每個(gè)藍(lán)蓋試劑瓶中加入84 mL蒸餾水，搖勻，接著稱取0.11 g葡萄糖放入第三個(gè)500 mL藍(lán)蓋試劑瓶中，加入10 mL蒸餾水和348 μL 72%H2SO4，將瓶蓋擰好并用牛皮紙（雙層）扎口（防止加熱時(shí)瓶蓋被頂開發(fā)生危險(xiǎn)）。將3個(gè)玻璃試劑瓶同時(shí)裝入高壓滅菌鍋中121℃反應(yīng)1 h待反應(yīng)結(jié)束后冷卻到25℃取出，將砂芯坩堝與抽濾裝置相連，將上述試劑瓶內(nèi)的秸稈水解液分別用坩堝漏斗進(jìn)行抽濾，并用50 mL離心管收集濾液，抽濾結(jié)束后用50 mL蒸餾水對秸稈殘?jiān)M(jìn)行淋洗。將盛有秸稈殘?jiān)?號和2號漏斗分別放入馬弗爐（575℃，24 h）和烘箱（105℃，4 h）中,待反應(yīng)結(jié)束后分別稱其重量，并記為W1+灰和 W2+酸不溶性殘?jiān)?，根?jù)公式（2）與公式（3）分別計(jì)算酸不溶性和酸可溶性木質(zhì)素含量。以4%H2SO4為對照，使用分光光度計(jì)測定濾液在320 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算酸可溶性木質(zhì)素的含量，酸不溶性與酸可溶性木質(zhì)素含量的總和即為秸稈總木質(zhì)素含量[74]。

樣品水解濾液和葡萄糖水解液中葡萄糖的含量用葡萄糖試劑盒分別進(jìn)行測定，糖的回收率可依據(jù)公式（4）計(jì)算，公式（5）可用來計(jì)算樣品中纖維素水解產(chǎn)生葡萄糖濃度，公式（6）可計(jì)算糖苷濃度，樣品纖維素含量可根據(jù)公式（7）來進(jìn)行計(jì)算。

公式（3）中：V水解液=濾液體積 87 mL（3 mL H2SO4+84 mL蒸餾水）

公式（5）中：C試劑盒為用試劑盒測得的樣品中葡萄糖的含量，Cx為纖維素水解產(chǎn)生的葡萄糖的濃度。

公式（6）中0.9為酐的效正值。

配制濃度為10 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，將其稀釋為 0.1、1、2、4 mg·mL-14 種濃度，加入 DNS 試劑并測其吸光度值，然后繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，再配制2.5 mg·mL-1葡萄糖溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線偏差的計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線偏差=測定的濃度/實(shí)際濃度×100% （8）

纖維素酶活采用國際標(biāo)準(zhǔn)方法[24]：將1條whatman濾紙條（長6 cm，寬1 cm）折疊放入試管底部，加入1 mL pH4.8的檸檬酸緩沖液（使濾紙條完全浸于液體中）和0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液混勻。50℃反應(yīng)60 min，加入3 mL DNS，沸水浴5 min后迅速冷卻，取200 μL到2.5 mL水中，OD540測吸光值。根據(jù)NREL計(jì)算方法，計(jì)算樣品中葡萄糖含量，找出其中釋放2 mg葡萄糖所對應(yīng)酶濃度，0.37與此酶濃度比值即為此纖維素酶的活力。

木聚糖酶活測定方法[25]：稱取1.0 g木聚糖溶于80 mL 50 mmol·L-1檸檬酸緩沖液中，60℃加熱至沸騰，冷卻過程中用磁力攪拌儀攪拌直至溶解，放置過夜后，用緩沖液補(bǔ)足至100 mL配制成10 mg·mL-1木聚糖溶液，4℃儲存最多放置一周。取1.8 mL 10 mg·mL-1木聚糖溶液于15 mL試管中，加200 μL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃水浴5 min，然后加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻，OD510處測其吸光值。計(jì)算每分鐘生成1 μmol產(chǎn)物需要的酶量，即一個(gè)酶活單位。

纖維二糖法測β-葡萄糖苷酶活[26]：用pH4.8檸檬酸緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，取1 mL酶液加入試管中，再加入1 mL 15 mmol·L-1纖維二糖，50℃反應(yīng)30 min，沸水浴5 min，迅速冷卻，用葡萄糖試劑盒測其葡萄糖含量。取1mL各個(gè)稀釋的酶液加入裝有1mLpH4.8檸檬酸緩沖液的試管中作為酶空白；取1 mL纖維二糖加入裝有1mLpH4.8檸檬酸緩沖液的試管中作為纖維二糖空白。在樣品葡萄糖含量為1mg·mL-1處找出對應(yīng)的酶濃度，取0.0926/酶濃度值為此苷酶的活力。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種微生物對玉米秸稈降解效果的對比

2.1.1 秸稈重量變化

圖1為2種微生物處理?xiàng)l件下單位體積秸稈不同發(fā)酵時(shí)間占初始重量的百分比?？梢钥闯?種處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加秸稈重量在減少，整個(gè)發(fā)酵期間哈茨木霉處理?xiàng)l件下秸稈重量都始終低于枯草芽孢桿菌處理，但是差別不大，且秸稈重量均在發(fā)酵10～16 d時(shí)降低速率最快。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，哈茨木霉處理剩余秸稈占初始重量的78.21%；枯草芽孢桿菌處理剩余秸稈占初始重量的79.88%。

圖1 秸稈重量隨時(shí)間的變化情況Figure 1 The weight changes of corn straw at different fermentation time

2.1.2 秸稈有機(jī)碳含量變化

2種微生物對秸稈有機(jī)碳含量的影響如圖2所示。2種處理下秸稈有機(jī)碳含量變化曲線相似，均隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，在發(fā)酵進(jìn)行到10～16 d時(shí)，2種微生物處理?xiàng)l件下秸稈含碳量下降速率均達(dá)到最高。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，哈茨木霉處理下秸稈含碳量較初始降低了4.43%；枯草芽孢桿菌處理下秸稈含碳量較初始降低了4.17%。

圖2 秸稈有機(jī)碳含量隨時(shí)間的變化情況Figure 2 The organic carbon content changes of corn straw at different fermentation time

2.1.3 剩余秸稈有機(jī)碳總量變化

圖3是剩余秸稈有機(jī)碳總量占初始百分比隨時(shí)間變化的情況。和秸稈重量變化情況類似，2種處理下秸稈有機(jī)碳總量均隨發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行逐漸降低，且2種處理下秸稈有機(jī)碳總量相差不大。在10～16 d時(shí)降解速率最高，25 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)，哈茨木霉和枯草芽孢桿菌處理下秸稈有機(jī)碳重量與初始相比分別降低了25.26%和23.46%。

2.1.4 2種微生物對秸稈纖維素降解率的對比

圖3 秸稈有機(jī)碳總量隨時(shí)間的變化情況Figure 3 The total organic carbon content changes of corn straw at different fermentation time

秸稈纖維素累積降解率如圖4所示。在發(fā)酵開始的前5d，哈茨木霉和枯草芽孢桿菌處理秸稈纖維素降解率相差不大，在發(fā)酵進(jìn)行5d后，哈茨木霉處理纖維素降解率開始快速上升，哈茨木霉處理均比發(fā)酵同期枯草芽孢桿菌處理秸稈纖維素累積降解率高，在發(fā)酵中期10～16d時(shí)2種處理纖維素降解速率均達(dá)到最高，在發(fā)酵進(jìn)行到25d時(shí)，哈茨木霉處理和枯草芽孢桿菌處理秸稈纖維素累積降解率分別為20.44%和13.90%。

圖4 秸稈纖維素累積降解率隨時(shí)間的變化情況Figure 4 The cellulose cumulative degradation of corn straw at different fermentation time

2.1.5 2種微生物對秸稈木質(zhì)素降解率的對比

圖5為2種微生物中秸稈木質(zhì)素累積降解率隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線。2種微生物處理下木質(zhì)素的降解速率隨著時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，發(fā)酵25 d時(shí)，哈茨木霉處理和枯草芽孢桿菌處理下秸稈木質(zhì)素累積降解率分別為38.10%和31.11%。

2.2 微生物酶活性變化情況

2.2.1 微生物纖維素酶活的變化情況

圖6為微生物纖維素酶活的變化情況。不同處理纖維素酶活都呈現(xiàn)先升后降的趨勢，哈茨木霉處理在發(fā)酵12 d時(shí)達(dá)到最高3.61 FPU·mL-1，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵14 d時(shí)達(dá)到最高2.91 FPU·mL-1。

圖5 秸稈木質(zhì)素累積降解率隨時(shí)間的變化情況Figure 5 The lignin cumulative degradation of corn straw at different fermentation time

圖6 纖維素酶活隨時(shí)間的變化情況Figure 6 The changes of cellulase activity at different fermentation time

2.2.2 微生物木聚糖酶活的變化情況

圖7為固態(tài)發(fā)酵的過程中，微生物木聚糖酶活的變化情況。哈茨木霉處理和枯草芽孢桿菌處理下都在發(fā)酵13 d時(shí)達(dá)到最高峰，分別為0.59、0.55 IU·mL-1，然后下降，到25 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別降到0.45、0.40 IU·mL-1。

2.2.3 微生物β-葡萄糖苷酶活的變化情況

β-葡萄糖苷酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的變化如圖8所示。2種處理下β-葡萄糖苷酶活都是隨發(fā)酵時(shí)間的增加先升高后下降，哈茨木霉處理下β-葡萄糖苷酶活最高為 72.22 IU·mL-1，最低為 25.93 IU·mL-1；枯草芽孢桿菌處理下β-葡萄糖苷酶活最高為62.96 IU·mL-1，最低為 22.22 IU·mL-1。

3 討論

圖7 木聚糖酶活隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況Figure 7 The changes of xylanase activity at different fermentation time

圖8 β-葡萄糖苷酶酶活隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況Figure 8 The changes of beta-glucosidase activity at different fermentation time

固態(tài)發(fā)酵后，哈茨木霉和枯草芽孢桿菌對玉米秸稈都有一定的降解效果，2種處理均在發(fā)酵10～16 d時(shí)玉米秸稈降解速率達(dá)到最高，同時(shí)哈茨木霉和枯草芽孢桿菌的纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶均在此時(shí)間段內(nèi)酶活性最高。這可能是因?yàn)槲⑸镌诩尤氲揭粋€(gè)新的環(huán)境中后需要一個(gè)適應(yīng)新環(huán)境的過程，經(jīng)過慢慢適應(yīng)之后開始分泌產(chǎn)生大量纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，使得這些酶的活性增加，進(jìn)而加快了秸稈的分解，導(dǎo)致在中期秸稈分解速率加快，到發(fā)酵后期相應(yīng)的酶活降低，秸稈的降解速率也隨之下降。Lee等[27]用里氏木霉發(fā)酵1∶1混合的甘蔗渣和棕櫚粕時(shí)，纖維素酶活在5 d時(shí)達(dá)到最高。李紅亞等[28]研究解淀粉芽孢桿菌MN-8菌株，在發(fā)酵24 d后，玉米秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素分別降解42.9%、40.6%和27.1%。

本實(shí)驗(yàn)中，哈茨木霉對秸稈的降解效果與枯草芽孢桿菌處理差別不大，但哈茨木霉處理的纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活都高于同時(shí)期的枯草芽孢桿菌處理。這可能是由于哈茨木霉屬于真菌，真菌降解纖維素的主要機(jī)制是分泌大量的胞外酶來破壞木質(zhì)纖維素的緊密結(jié)構(gòu)，從而有效降解玉米秸稈；枯草芽孢桿菌屬于細(xì)菌，細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的機(jī)制是主要通過分泌的纖維素酶的纖維素結(jié)合域附著在木質(zhì)纖維素的表面，纖維素受細(xì)菌作用易于膨脹而被破壞分解[29]。雖然2種微生物降解玉米秸稈機(jī)制不同，但哈茨木霉處理玉米秸稈降解效果與枯草芽孢桿菌相差不大，酶活略高于枯草芽孢桿菌。

4 結(jié)論

發(fā)酵第10～16 d時(shí)，哈茨木霉和枯草芽孢桿菌處理的玉米秸稈分解速率、纖維素酶活、木聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活均達(dá)到最高；發(fā)酵25 d后，2種微生物的玉米秸稈分別累積降解了21.79%和20.12%。說明添加哈茨木霉和枯草芽孢桿菌均可以降解秸稈，但哈茨木霉與枯草芽孢桿菌對玉米秸稈的降解效果差異不明顯。鑒于這2種微生物對玉米秸稈有較好的分解效果，可在玉米秸稈肥料化利用中使用哈茨木霉或枯草芽孢桿菌制成的秸稈腐熟劑，使玉米秸稈在農(nóng)田中快速分解，縮短玉米秸稈在農(nóng)田中的分解時(shí)間。

[1]常志州,靳紅梅,黃紅英,等.“十三五”江蘇省秸稈綜合利用策略與秸稈產(chǎn)業(yè)發(fā)展的思考[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,32（3）：534-541.CHANG Zhi-zhou,JIN Hong-mei,HUANG Hong-ying,et al.New thinking regarding integrated utilization strategy and industrial development of crop straws in Jiangsu Province for the 13th Five Year Plan[J].Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,2016,32（ 3）：534-541.

[2]吳文韜,鞠美庭,劉金鵬,等.一株纖維素降解菌的分離、鑒定及對玉米秸稈的降解特性[J].微生物通報(bào),2013,40（4）：712-719.WU Wen-tao,JU Mei-ting,LIU Jin-peng,et al.Isolation,identification and corn stalk degradation characteristics of cellulose-degrading bacterial strain NH11[J].Microbiology China,2013,40（4）：712-719.

[3]吳鴻欣,曹洪國,韓增德,等.中國玉米秸稈綜合利用技術(shù)介紹與探討[J].農(nóng)業(yè)工程,2011,1（3）：9-12.WU Hong-xin,CAO Hong-guo,HAN Zeng-de,et al.Introduction and discussion of cornstalk utilization technology in china[J].Agricultural Engineering,2011,1（3）：9-12.

[4]曹國良,張小曳,龔山陵,等.中國區(qū)域主要顆粒物及污染氣體的排放源清單[J].科學(xué)通報(bào),2011,56（3）：261-268.CAO Guo-liang,ZHANG Xiao-ye,GONG Shan-ling,et al.Emission inventories of primary particles and pollutant gases for China[J].Chinese Sci Bull,2011,56（3）：261-268.

[5]曹國良,張小曳,鄭方成,等.中國大陸秸稈露天焚燒的量的估算[J].資源科學(xué),2006,28（1）：9-13.CAO Guo-liang,ZHANG Xiao-ye,ZHEN Fang-cheng,et al.Estimating the quantity of crop residues burnt in open field in China[J].Resources Science,2006,28（1）：9-13.

[6]Martinez D,Larrondo L F,Putnam N,et al.Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78[J].Nature Biotechnology,2004,22（6）：695-700.

[7]Heck J X,Hertz P F,Ayub M A Z.Cellulase and xylanase production by isolated amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-statecultivation[J].BrazilianJournalofMicrobiology,2002,33（3）：213-218.

[8]S′anchez C,et al.Lignocellulosic residues：Biodegradation and bioconversion by fungi[J].Biotechnology Advances,2009,27（2）：185-194.

[9]Akin D E,Rigsby L L,Sethuraman A,et al.Alterations in structure,chemistry,and biodegradability of grass lignocellulose treated with the white rot fungi Ceriporiopsis subvermispora and Cyathus stercoreus[J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61（4）：1591-1598.

[10]顧文杰,張發(fā)寶,徐培智,等.篩選兩株稻桿降解放線菌 [J].微生物學(xué)報(bào),2012,52（9）：1085-1093.GU Wen-jie,ZHANG Fa-bao,XU Pei-zhi,et al.Screening of two straw-cellulose degrading actinomycetes[J].Acta Microbiologica Sinica,2012,52（9）：1085-1093.

[11]Gong W L,Zhang H Q,Liu S J,et al.Comparative secretome analysis of aspergillus niger,trichoderma reesei,and penicillium oxalicum during solid-state fermentation[J].Appl Biochem Biotechnol,2015,177：1252-1271.

[12]Glass N L,Schmoll M,Cate J H,et al.Plant cell wall deconstruction by ascomycete fungi[J].Annual Review of Microbiology,2013,67：477-498.

[13]Ahmed S,Bashir A,Saleem H,et al.Production and purification of cellulose degrading enzymes from a filamentous fungus Trichoderma harzianum[J].Pakistan Journal of Botany,2009,41（3）：1411-1419.

[14]Castro A,Ferreira M,Cruz J.High-yield endoglucanase production by Trichoderma harzianum：Cultivated in pretreated sugarcane mill byproduct[J].Enzyme Research,2010,IOC-3844：1-8.

[15]Nelson L,Carlos R S,Aristoteles G N,et al.Domestic wastewater as substrate for cellulase production by Trichoderma harzianum[J].Process Biochemistry,2017,PRBI-10964：1-10.

[16]Vanessa A,Roberto N,Lidia M,et al.Sugarcane bagasse as feedstock for cellulose production by Trichoderma harzianum in optimized culture medium[J].Electronic Journal of Biotechnology,2013,16（5）：1-13.

[17]王 毅.農(nóng)林廢物堆肥化中細(xì)菌對木質(zhì)素的降解及產(chǎn)酶研究[D].長沙：湖南大學(xué),2008.WANG Yi.Research of lignin degrading ability and the enzyme production by bacteria in agriculture and forestry waste composting[D].Changsha：Hunan University,2008.

[18]Amir J,Naeem R,Nouman R,et al.Gene cloning and characterization of a xylanase from a newly isolated Bacillus subtilis strain R5[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2009,107（4）：360-365.

[19]謝鳳行,張峰峰,周 可,等.原生質(zhì)體誘變選育高纖維素酶活性枯草芽孢桿菌的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,25（5）：211-214.XIE Feng-xing,ZHANG Feng-feng,ZHOU Ke,et al.The mutagenesis of Bacillus subtilis protoplast for screening highly producing cellulase strains[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2010,25（5）：211-214.

[20]王堯悅,曹平華,陳玉林,等.一株纖維素降解菌的鑒定及其對飼料粗纖維的降解效果[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2016,44（7）：16-24.WANG Yao-yue,CAO Ping-hua,CHEN Yu-lin,et al.Identification of a cellulose-decomposing strain and its application for degrading different cellulosic materials[J].Journal of Northwest A&F University（Nat.Sci.Ed）,2016,44（7）：16-24.

[21]劉艷麗.細(xì)菌利用纖維素和木質(zhì)素形成腐殖質(zhì)研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.LIU Yan-li.Study on formation of humus by bacteria with cellulose and lignin[D].Changchun：Jilin Agricultural University,2011.

[22]魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社,2000.LURu-kun.Analyticalmethodsforsoilandagro-chemistry[M].Beijing：China Agricultural Science and Technology Press,2000.

[23]Sluiter A,Hames B,Ruiz R,et al.Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.National Renewable Energy Laboratory（NREL）Laboratory Analytical Procedures（LAP）for standard biomass analysis[R].NREL/TP-510-42618,2008.

[24]GhoseTK.Measurementofcellulaseactivities[J].PureApplChem,1987,59（2）：257-268.

[25]Bailey M J,Biely P,Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J].Journal of Biotechnology,1992,23（3）：257-270.

[26]Jabasingh S A.Response surface methodology for the evaluation and comparison of cellulase production by Aspergillus nidulans SU04 and Aspergillus nidulans MTCC 344 cultivated on pretreated sugarcane bagasse[J].Chemical&BiochemicalEngineeringQuarterly,2011,25（4）：501-511.

[27]Lee C K,Darah I,Ibrahim C O.Production and optimization of cellulase enzyme using Aspergillus niger USM AI 1 and comparison with trichoderma reesei via solid state fermentation system[J].Biotechnology Research International,2011,10：1-6.

[28]李紅亞,李術(shù)娜,王樹香,等.解淀粉芽孢桿菌MN-8對玉米秸稈木質(zhì)纖維素的降解[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2015,26（5）：1404-1410.LI Ya-hong,LI Shu-na,WANG Shu-xiang.et al.Degradation of lignocellulose in the corn straw by Bacillus amyloliquefaciens MN-8[J].Chinese Journal of Applied Ecology,2015,26（ 5）：1404-1410.

[29]張斯童,蘭 雪,李 哲,等.微生物降解玉米秸稈的研究進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,38（5）：517-522.ZHANG Si-tong,LAN Xue,LI Zhe,et al.Research progress of microbial degradation of corn straw[J].Journal of Jilin Agricultural University,2016,38（5）：517-522.

Comparative study of the degradation efficiency of 2 types of microorganisms on the degradation of corn stalks in solid-state fermentation

LI Li-bo1,REN Xiao-dong2,DOU Sen1*
（1.College of Resources and Environment,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.College of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130118,China）

The efficiency of Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis to organic carbon,cellulose,lignin content,cellulase activity,xylanase activity and β-glucosidase activity in the process of solid-state fermentation were studied and compared to discuss the efficiency of different microorganisms on the degradation of corn stalk under the solid-state fermentation during 25 days.The research result showed that the decomposition rate of corn stalk,cellulase activity,xylanase activity and β-glucosidase activity of Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis were the highest at 10 to 16 days of fermentation.After 25 days of fermentation,Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis corn stalk was degraded by 21.79%and 20.12%.The results showed that the degradation effect of Trichoderma harzianum on corn stalks was not significantly different from that of Bacillus subtilis；the residual amount of straw,straw total organic carbon content and residual straw organic carbon were reduced by 1.67%,0.26%and 1.80%,compared with Bacillus subtilis treatment,respectively.The cumulative degradation ofcellulose,lignin,the cellulase activity,xylanase activity and β-glucosidase activity were increased by 6.99%,6.54%,0.7 FPU·mL-1,0.04 IU·mL-1and 9.26 IU·mL-1,respectively.The results indicated that corn stalks can be degraded by Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis,the degradation efficiency of Trichoderma harzianum on corn stalks was not significantly different from that of Bacillus subtilis.

solid-state fermentation;corn stalks;Trichoderma harzianum;Bacillus subtilis

X712

A

1672-2043（2017）10-2136-07

10.11654/jaes.2017-0336

李立波，任曉冬，竇 森,等.固態(tài)發(fā)酵中2種微生物降解玉米秸稈效果的對比研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（10）：2136-2142.

LI Li-bo,REN Xiao-dong,DOU Sen,et al.Comparative study of the degradation efficiency of 2 types of microorganisms on the degradation of corn stalks in solid-state fermentation[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（10）：2136-2142.

2017-03-10 錄用日期：2017-06-01

李立波（1994-），男，山西忻州人，碩士研究生，從事土壤生物化學(xué)研究。E-mail：bobobo1663@126.com

* 通信作者：竇森 E-mail：dousen@tom.com

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41571231）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0200304）；吉林省秸稈綜合利用平臺項(xiàng)目（2014C-1）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（41571231）;National Key Research Projects of China（2016YFD0200304）;The Jilin Provincial Straw Platform for Comprehensive Utilization,China（2014C-1）