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(南華大學病原生物學研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

·小專論·

RIPK1/RIPK3依賴的細胞程序性壞死在清除兼性胞內菌感染中的作用

羅茜，張曉紅，趙飛駿*

(南華大學病原生物學研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

程序性壞死是一種與炎癥相關的細胞死亡模式，與依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶調控的凋亡不同，這種細胞死亡模式受受體互作蛋白激酶(RIPK)1和3調控。在兼性胞內菌感染過程中，宿主會運用多種策略使隱藏在細胞內的兼性胞內菌重新暴露于抗菌機制面前。許多研究報道表明宿主細胞的程序性壞死是其中一種重要的策略，有助于兼性胞內菌感染的清除。在本文中，我們將探討在宿主細胞內發(fā)生的由RIPK1/RIPK3途徑介導的程序性壞死機制，以及其在清除兼性胞內菌感染中的意義。

RIPK1/RIPK3； 細菌感染； 程序性壞死

細胞死亡被分為程序性死亡和非程序性死亡。常見的細胞程序性死亡比如凋亡[1]，主要由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)介導；非程序性死亡主要指壞死(Necrosis)[2]。壞死一直以來被認為是機體應對外來刺激時發(fā)生的一種有積極意義的非程序性細胞死亡形式。最近一些研究表明，壞死不僅僅局限于非程序性死亡，它在細胞水平上也表現出一種受信號通路調節(jié)的程序性死亡的特點。這種可調節(jié)的壞死可以出現在病原體與宿主之間相互作用的過程中，它能幫助宿主抵抗病原體的損害。目前，大致把這種可調節(jié)的壞死分為鐵死亡(Ferroptosis)[3]、 線粒體通透性轉換(Mitochondria permeability transition，MPT)[4]介導的壞死、焦亡(Pyroptosis)[5]和程序性壞死(Necroptosis)[6]。

1 RIPK1/RIPK3依賴的細胞程序性壞死

受體互作蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)由3個功能明確的結構域組成：N端激酶結構域，中間結構域，C端死亡結構域。RIPK1激酶功能結構域對程序性壞死很重要。中間結構域包含一個RHIM(RIP-homotypic interaction motif)結構，能幫助RIPK1與其它包含RHIM的蛋白相互作用，比如DNA依賴的干擾素調節(jié)活化因子(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI)，β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β,TRIF)，受體互作蛋白激酶3(Receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)。RIPK3與RIPK1具有高度同源性，具有一樣的激酶功能結構域和RHIM結構。RHIM結構之間的相互作用在細胞程序性壞死過程中具有重要意義。而RIPK1 C端的死亡結構域能調節(jié)其與死亡受體(TNFR1，Fas)之間的反應[7]。RIPK1包含的這些功能明確的結構域在調節(jié)細胞死亡信號通路發(fā)揮強有力的作用。而目前研究認為程序性壞死指的就是由RIPK1/RIPK3依賴的細胞死亡。

目前關于程序性壞死的研究大多數都是建立在腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)誘導基礎上。TNF是一種能誘導腫瘤細胞壞死的細胞因子。現有研究表明，TNF相關信號通路既能介導細胞凋亡也能介導細胞程序性壞死(圖1)。細胞凋亡是一種依賴于caspase的程序性死亡；而程序性壞死則是主要通過RIPK1/RIPK3誘導的細胞壞死。當TNF與宿主細胞表面的TNFR1結合時，能在其受體通路下游募集形成一種低聚物—復合體Ⅰ。復合體Ⅰ主要由RIPK1和一些輔助因子(比如TRADD、LUBAC、cIAPs和TRAF2/5)組成，輔助因子中的cIAPs和TRAF2/5能使RIPK1多聚泛素化，進而活化NF-κB相關信號通路，而NF-κB信號相關通路又能提高細胞的存活率。當復合體Ⅰ被破壞的時，RIPK1能重新與RIPK3和caspase-8結合，形成復合體Ⅱa，誘導細胞凋亡。當caspase-8活化程度不高或者RIPK3和MLKL (Mixed lineage kinase domain-like protein)的表達水平比較高時，復合體Ⅱ中的RIPK1和RIPK3就能互相磷酸化，使其本身被激活?；罨腞IPK3又能使MLKL磷酸化，這三者組成復合體Ⅱb促進程序性壞死的發(fā)生?；罨腗LKL能作用于細胞膜上的離子通道，通過對離子通道的調控進而調節(jié)細胞的滲透壓，導致細胞腫脹，細胞膜破碎，最終使細胞死亡[8]。最新的研究表明，除TNFR1能介導細胞程序性壞死外，Ⅰ型干擾素(Type I interferon，IFN-Ⅰ)受體也能介導細胞程序性壞死(圖1)，機制與TNFR1類似[9]。

圖1 TNFR1和IFN-ⅠR介導的細胞程序性壞死

2 宿主細胞發(fā)生RIPK1/RIPK3依賴的細胞程序性壞死在清除兼性胞內菌感染中的作用

宿主細胞死亡，將影響細胞內寄生細菌的感染和增殖。宿主細胞調控的由RIPK1/RIPK3信號通路介導的程序性壞死在細菌感染過程中占據了重要位置。目前發(fā)現結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)、沙門菌(Salmonella)、單核細胞增生李斯特菌(Liseria monocytogenes)和鼠疫耶爾森菌(Yersinia)等多種兼性胞內菌感染與RIPK1/RIPK3信號通路介導的細胞程序性壞死相關。

2.1結核分枝桿菌結核分枝桿菌是一種兼性胞內菌，是人類常見的呼吸道傳染性的疾病肺結核的病原菌。根據世界衛(wèi)生組織(WHO)的數據統計，平均每年有150萬人死于這種細菌殺手。肺結核的發(fā)生是一種非常復雜的過程，具體的機制還不明確，但有一點可以肯定的是巨噬細胞在控制肺結核感染過程中發(fā)揮重要作用[10]。研究人員最近利用海魚分枝桿菌感染斑馬魚幼仔建立了與結核分枝桿菌侵入人體相似的動物模型，在實驗過程中發(fā)現在被分枝桿菌感染的巨噬細胞中當TNF信號通路被激活后，能誘導細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產生，ROS能增強斑馬魚幼仔對海魚分枝桿菌的抵抗力[11]。這條通路激活能夠減少分枝桿菌在細胞內的數量同時也能防止被感染的巨噬細胞死于由細菌誘導的細胞死亡。但是在大多數結核分枝桿菌感染中，如果巨噬細胞被感染程度比較嚴重時，細胞內的TNF信號通路就能激活RIPK1/RIPK3信號通路從而導致細胞發(fā)生程序性壞死[12]，細胞膜破損，在巨噬細胞內大量存在的結核分枝桿菌就會被釋放出來。結核分枝桿菌失去生存所必須的營養(yǎng)供給環(huán)境，同時又被暴露在宿主免疫系統面前，最終被清除。

2.2傷寒沙門菌沙門菌病是一種常見的食源性細菌感染性疾病，主要的臨床表現為發(fā)熱、腹瀉與腹痛。在美國，每年傷寒沙門菌能感染100萬人，在這100萬人中大約有400人因此喪命[13]。傷寒沙門菌是一種兼性胞內菌，有研究表明它在體內和體外實驗中均能引起巨噬細胞和上皮細胞的死亡[14]。在20年前，研究人員就認為沙門菌引起巨噬細胞的死亡可能是通過凋亡通路實現[15]。但在近年的研究發(fā)現這種沙門菌引起巨噬細胞的死亡并非通過caspase-3或者caspase-8介導的凋亡完成，而是通過caspase-1和caspase-11介導的焦亡通路完成[16]。還有研究證實沙門菌可以激活細胞內的IFN-I信號通路，隨后將誘導巨噬細胞發(fā)生程序性壞死[16]。研究人員用抗IFN-I受體的中和抗體與巨噬細胞共培養(yǎng)，之后再用沙門菌感染，發(fā)現巨噬細胞沒有出現大量死亡。研究者又分別用3種方式預處理的巨噬細胞，依次是用necrostatin-1抑制RIPK1的巨噬細胞、敲除IFN-I受體的巨噬細胞和敲除RIPK3的巨噬細胞，之后都用沙門菌感染，最后發(fā)現巨噬細胞死亡數都有明顯的降低[9]。在更深入的研究中，研究人員用沙門菌感染IFN-I受體和RIPK3缺陷型的小鼠，發(fā)現這兩種小鼠的巨噬細胞數明顯比同樣感染的野生型小鼠的巨噬細胞多，前兩者的細菌滴度明顯比野生型小鼠的細菌滴度低[9]。在這個例子中，巨噬細胞的程序性壞死有利于限制沙門菌在巨噬細胞內的增殖。

2.3單核細胞增生李斯特菌單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種兼性胞內病原菌，它在感染宿主巨噬細胞內或者非巨噬細胞內都能復制生存。一旦LM被宿主細胞以吞噬小體的形式吞進胞內后，在被運送至溶酶體之前，其產生的毒力因子李斯特菌溶血素O(Listeriolysion O,LLO)就會發(fā)揮作用，幫助其從吞噬小體中逃離，從而避免被溶酶體中各類酶降解破壞。之前有研究認為LM可引起的巨噬細胞死亡，可能與焦亡有關而不是凋亡[17]。但最近有研究發(fā)現一種非焦亡并與炎癥相關的細胞死亡可能也參與到LM導致巨噬細胞死亡過程中來，當LM感染小鼠后，小鼠肝臟中的Kuffer細胞會發(fā)生大量死亡并伴隨有大量炎癥因子的分泌。這種死亡方式不依賴caspase-1就可以發(fā)生，所以排除細胞發(fā)生焦亡。此外，當小鼠感染Dhly基因突變株(不產生LLO的LM)后，Kupffer細胞死亡就沒有發(fā)生，一般含有LLO的LM能激發(fā)宿主細胞產生TNF[18]，最近有研究證實LLO家族的前體也能通過直接活化RIPK1/RIPK3信號通路來誘導細胞程序性死亡[8]。因此有理由相信這種細胞死亡是穿孔素(LLO)與RIPK1/RIPK3信號通路導致的程序性壞死。同時，當LM感染Ifnar-/-小鼠，發(fā)現Kupffer細胞同樣沒有出現死亡，提示I型干擾素介導的信號通路極有可能也在LM導致的Kupffer細胞死亡機制中發(fā)揮了重要作用。而用LM去感染RIPK1的抑制劑necrostatin-1預先處理的小鼠后，Kupffer細胞死亡數量明顯減少。以上數據均提示RIPK1/RIPK3信號通路介導的細胞程序性死亡在清除LM感染的過程中發(fā)揮重要作用。

2.4鼠疫耶爾森菌鼠疫耶爾森菌是一種革蘭陰性細菌，是鼠疫的主要病原菌。鼠疫主要的臨床表現為發(fā)燒、腹痛、腹瀉同時在脾臟、肝臟和淋巴結伴有組織壞死和肉芽腫的形成[19]。鼠疫耶爾森菌一系列的外膜蛋白(Yops)是其主要的毒力因子，Yops通過細菌的三型分泌系統進入宿主細胞中發(fā)揮作用[20]。最近的一些研究發(fā)現當使用necrostatin-1抑制RIPK1后，由鼠疫耶爾森菌誘導的巨噬細胞死亡數降低。用鼠疫耶爾森菌感染RIPK1缺陷巨噬細胞后，細胞死亡數也大量減少，這表明RIPK1在鼠疫耶爾森菌誘導宿主巨噬細胞死亡過程中發(fā)揮著關鍵作用[7]。再進一步探索研究研究者發(fā)現鼠疫耶爾森菌誘導巨噬細胞大量死亡不僅需要RIPK1參與，同時也需要Caspase-8和RIPK3的加入[20]。有趣的是，當單獨抑制或敲除Caspase-8和RIPK3兩種分子的一種，巨噬細胞死亡并不能被完全阻止，只有當同時抑制或敲除Caspase-8和RIPK3時，巨噬細胞死亡才會被完全抑制[7]。以上研究發(fā)現表明在鼠疫耶爾森菌誘導巨噬細胞死亡過程中，其激活RIPK1后，RIPK1既能活化Caspase-8依賴的凋亡途徑也能活化RIPK3依賴的程序性壞死途徑最終導致巨噬細胞死亡。人們認為在鼠疫耶爾森菌感染宿主細胞時發(fā)生RIPK1和RIPK3依賴的程序性壞死主要是YopJ在其中發(fā)揮了重要作用，YopJ是鼠疫耶爾森菌一種外膜蛋白毒力因子。用缺少YopJ的鼠疫耶爾森菌突變體感染巨噬細胞，RIPK1和RIPK3依賴的程序性壞死在很大程度上被抑制[7]。巨噬細胞發(fā)生程序性壞死，有利于宿主清除入侵機體的鼠疫耶爾森菌。

3 小結與展望

文中介紹的幾種兼性胞內菌在感染宿主時，宿主細胞尤其是最先與細菌接觸并能把菌體吞噬的巨噬細胞發(fā)生由RIPK1/RIPK3信號通路介導的程序性壞死。這種細胞死亡方式最大特點就是細胞膜發(fā)生破損，細胞內容物溢出引起宿主強烈的免疫反應，包括更多炎癥因子的分泌以及更多免疫細胞聚集到感染部位發(fā)揮抗菌作用，同時兼性胞內菌也無法從破碎的細胞中獲得生存所需的營養(yǎng)，最終導致入侵宿主的細菌被清除。這種死亡方式會導致部分的宿主細胞死亡，但這些已經被感染的細胞已經無法發(fā)揮正常功能，還可能會成為細菌增殖的溫床，所以宿主選擇讓這些細胞死亡，對整個宿主抗感染過程具有重要意義。

細菌感染可以調節(jié)宿主細胞的多種應答反應。其中一種應答反應就是細胞程序性壞死。程序性壞死在病原體感染宿主過程中發(fā)揮積極作用。這種由 RIPK1和RIPK3介導的細胞程序性壞死，一方面能夠幫助清除已經被細菌感染的宿主細胞，另一方面可以使某些已經被宿主細胞胞吞的兼性胞內菌重新暴露在宿主的抗菌機制面前，幫助宿主清除這些細菌，消除感染。在研究病原體感染和宿主細胞死亡過程中，我們需要全面的看待宿主細胞死亡的作用，不能只看到細胞死亡對宿主不利的一面，還需要看到細胞死亡對宿主有利的方面，綜合分析才能了解清楚機體與病原體之間相互影響的真正意義。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.018

2016-12-23；

2017-02-21

國家自然科學基金(81373230，81301470).

*通訊作者，E-mail:hengyangzhfj@126.com.

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