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(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科 528403)

·臨床醫(yī)學(xué)·

原位雜交與免疫組化技術(shù)用于評價(jià)化療后結(jié)直腸癌患者M(jìn)LH1、MSH2和hMSH6表達(dá)水平的對比研究

羅教秀，儲兵，曹曉珊，黃志偉，吳師珍，杜娟*

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科 528403)

目的探討原位雜交方法和免疫組化方法兩種不同方法在檢測評價(jià)直腸癌術(shù)后新輔助化療治療后患者三種錯配修復(fù)蛋白(hMLH1、hMSH2和hMSH6)表達(dá)水平的效果。方法選取本院收治的散發(fā)性結(jié)直腸癌(SCRC)患者260例，取手術(shù)切除的腫瘤組織，使用較原位雜交和免疫組化法測定hMLH1、hMSH2和hMSH6表達(dá)水平的效果，比較三種指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果不同部位的腫瘤各種特征之間未見明顯差別。原位雜交法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6的陽性率顯著高于免疫組化檢測的陽性率；免疫組化法檢測結(jié)果提示hMLH1與hMSH2的表達(dá)無明顯相關(guān)性，hMLH1或hMSH2與hMSH6表達(dá)分別呈正相關(guān);原位雜交法檢測結(jié)果提示hMLH1與hMSH2，hMLH1與hMSH6，hMSH2與hMSH6表達(dá)均呈正相關(guān)。結(jié)論原位雜交法和免疫組化方法兩種方法在檢測評價(jià)直腸癌術(shù)后輔助化療后患者三種錯配修復(fù)蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6表達(dá)水平的效果中原位雜交法更優(yōu)。

原位雜交； 免疫組化； 結(jié)直腸癌； 錯配修復(fù)基因蛋白

錯配修復(fù)基因(mismatch repair gene,MMR)蛋白的表達(dá)缺失常見于散發(fā)性的結(jié)直腸癌(sporadic colorectal carcinoma,SCRC)患者中，該病的發(fā)生、發(fā)展過程均可能存在潛在的關(guān)聯(lián)，對于MMR蛋白在SCRC中表達(dá)的具體狀態(tài)以及其與臨床病理參數(shù)之間的相互關(guān)聯(lián)，尚鮮有研究涉及，而此類相關(guān)研究的結(jié)論將大大增加人們對于SCRC生物學(xué)行為的認(rèn)識，以及對其發(fā)病機(jī)制的深入探索[1-3]。免疫組化技術(shù)已經(jīng)是檢驗(yàn)界非常成熟和常用的方法之一，這種方法雖常用，但也存在著許多問題,如?？梢娕R床上出現(xiàn)HE切片比較典型而免疫組化卻提示陰性的案例；近年來發(fā)展起來的原位雜交技術(shù)是利用堿基配對原理，結(jié)合組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)的檢測技術(shù)的檢測方法，顯示出自己的優(yōu)勢[4-6]。本研究通過免疫組化法和原位雜交兩種方法分別對SCRC腫瘤組織中3種MMR蛋白(hMLH1、hMSH2和hMSH6)的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行測定，然后進(jìn)行比較評價(jià),希望有助于為SCRC患者制定個體化的化療方案，并未判斷患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料選取本院2013年至2015年間收治的SCRC患者260例，其中男140例，女120例；平均年齡(62.7±11.2)歲；腫瘤部位：本研究中腫瘤右半結(jié)腸的患者有75例，位于左半結(jié)腸90例，直腸腫瘤患者98例；從組織分化程度角度來看：高分化腺癌患者共計(jì)20例，中分化腺癌共165例，低分化及黏液性腺癌78例；從淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移角度統(tǒng)計(jì)：研究中轉(zhuǎn)移陽性病例149例，轉(zhuǎn)移陰性114例。全部患者未進(jìn)行過放化療，手術(shù)切除腫瘤組織固定后石蠟包埋備用。全部患者知情同意。

1.2材料與方法研究中使用試劑均為上海長嘉生物科技有限公司，即用型hMLH1鼠抗人單克隆抗體工作液(W-0721)、即用型hMSH2鼠抗人單克隆抗體工作液(W-0722)和即用型hMSH6鼠抗人單克隆抗體工作液(W-0723)。免疫組化測定使用Benchmark XT自動染色儀系統(tǒng)，手工滴定運(yùn)行方式(手工加抗體)完成,Olympus Dp70圖像采集分析儀完成研究中的行圖像獲取工作。原位雜交檢測(ISH)法檢測使用石蠟切片脫蠟后，置于0.8%胃蛋白酶鹽酸混合液中,37 ℃水浴箱消化10 min，使用TBS洗5 min，乙醇脫水然后室溫干燥。98 ℃變性10 min后冰浴退火,再置于37 ℃水浴箱中雜交1h，雖有TBS洗在洗滌5 min，共3次，滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體后,室溫放置0.5 h，洗滌兩次后加BCIP/NBT并于暗處顯色,然后使用0.3%核固紅襯染,常規(guī)脫水后透明封片。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：hMLH1、hMSH2、hMSH6三種蛋白的表達(dá)陽性均定位于細(xì)胞核內(nèi)，所以本研究中依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率來進(jìn)行計(jì)算評分[4-6]。以在200倍的視野下隨機(jī)的10個視野為計(jì)數(shù)對象,記數(shù)每個視野中正常黏膜以及腫瘤細(xì)胞的染色情況。染色強(qiáng)度的評價(jià)見于0分：無染色,1分：弱染色,2分：中等染色,3分：強(qiáng)染色。陽性細(xì)胞率:0為<1%；1為<25%；2為<50%；3為<75%；4為≥75%。最后以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞率之和作為評分:0～2分：陰性,3～5分：陽性,6～7分：強(qiáng)陽性。評價(jià)過程采取雙盲法。

1.4統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用兩個(或多個)樣本率比較的χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)或方差分析完成；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1原位雜交法與免疫組化法檢測指標(biāo)陽性情況如見表1所示，與免疫組化(IHC)檢測各指標(biāo)的陽性率比較，原位雜交法(ISH)檢測hMLH1，hMSH2，hMSH6的陽性率較高，分別為65.00%，63.46%，61.54%。

表1 原位雜交和免疫組化檢測三種指標(biāo)的陽性率對比

與IHC方法比較:b:P<0.01

2.2兩種方法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6表達(dá)陽性的相關(guān)性分析分別使用兩種檢測方法得出的三種指標(biāo)的檢測陽性率結(jié)果，然后分別進(jìn)行三種指標(biāo)之間的相關(guān)性分析，使用免疫組化法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC腫瘤組織中表達(dá)陽性率的相關(guān)分析。結(jié)果提示，hMLH1與hMSH2的表達(dá)無明顯相關(guān)性(rs=0.07，P=0.263)，hMLH1與hMSH6表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.45，P<0.01)，hMSH2與hMSH6表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.37，P=0.004);而是用原位雜交法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC腫瘤組織中表達(dá)陽性率的相關(guān)分析結(jié)果提示hMLH1與hMSH2的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.10，P=0.033)，hMLH1與hMSH6表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.56，P<0.01)，hMSH2與hMSH6表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.63，P<0.01)(見表2)?；颊?，男，54歲典型病例圖片見圖1～2。

表2 兩種方法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6表達(dá)陽性的相關(guān)性分析對比

a:P<0.05,b:P<0.01

圖1 免疫組化法測定結(jié)直腸癌患者(200×) A:MLH1,B:MSH2,C:hMSH6

圖2 原位雜交法測定結(jié)直腸癌患者(200×) A:MLH1,B:MSH2,C:hMSH6

3 討 論

結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病患病近年來顯著增加，且有年輕化趨勢，明確疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律對于診斷治療作用重大，對于診治工作能夠真正有的放矢具有重要意義。有研究提示錯配修復(fù)基因的種系突變，以及突變所引起的微衛(wèi)星穩(wěn)定性欠佳都可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在潛在聯(lián)系[7-9]，本研究中使用免疫組織化學(xué)方法對hMLH1、hMSH2、hMSH6三個主要的錯配修復(fù)基因蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行測定,比較指標(biāo)之間的相互聯(lián)系，進(jìn)而間接判斷SCRC腫瘤組織中該基因的突變情況，結(jié)果提示，使用免疫組化法檢測SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達(dá)陽性率，通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，hMLH1與hMSH2的表達(dá)無顯著相關(guān)性，而hMLH1與hMSH6的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，hMSH2與hMSH6的表達(dá)也呈正相關(guān);同時(shí)應(yīng)用原位雜交方法進(jìn)行同期測定，結(jié)論相似，且原位雜交法更為精準(zhǔn)。本研究中，陽性率分析結(jié)果提示原位雜交法檢測hMLH1的陽性率為65.00%，顯著高于免疫組化檢測的陽性率，檢測hMSH2和hMSH6的陽性率也表現(xiàn)為原位雜交法的陽性率高于免疫組化檢測的陽性率，這些結(jié)果均提示原位雜交法具有較高的可信度和準(zhǔn)確度。究其原因，主要與原位雜交技術(shù)的原理相關(guān)，其探針是根據(jù)堿基配對原則來完成檢測的，檢測過程中因?yàn)閮H與靶基因序列雜交，所以探針—靶核酸的結(jié)合力要強(qiáng)于抗原—抗體的結(jié)合力,因此在一定程度上減少了免疫組化方法中容易出現(xiàn)的假陽性和假陰性問題。另一方面，原位雜交法使用福爾馬林固定組織，不會與蛋白產(chǎn)生交聯(lián)作用,所以DNA和mRNA蛋白質(zhì)所受的影響也相對都比較小，而免疫組化方法中組織因?yàn)槭褂酶栺R林固定而容易產(chǎn)生蛋白交聯(lián),對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響就會比較大。從操作層面上來說原位雜交法也相對更具優(yōu)勢，該方法具有耗時(shí)更少，而且操作更方便和安全的優(yōu)勢特征[10-11]。

綜上，原位雜交法和免疫組化方法兩種不同方法在檢測評價(jià)直腸癌術(shù)后新輔助化療治療后患者三種錯配修復(fù)蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6表達(dá)水平的效果中原位雜交法更優(yōu)，值得臨床推廣。

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AcomparisonofinsituhybridizationandimmunohistochemistryinevaluatingtheexpressionofMLH1,MSH2andhMSH6incolorectalcancerpatientsafterchemotherapy

LUO Jiaoxiu,CHU Bing,CAO Xiaoshan,et al

(DepartmentofPathology;ZhongshanHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversityGuangzhou528403,Guangdong,China)

ObjectiveTo evaluate the expression of three mismatch repair proteins (hMLH1,hMSH2 and hMSH6) in neoadjuvant chemotherapy patients after rectal cancer resection by two different methods of in situ hybridization and immunohistochemistry.Methods260 patients suffered from sporadic colorectal carcinoma(SCRC) admitted to our hospital were studied.The expression of hMLH1,hMSH2 and hMSH6 were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry,the correlation of hMLH1,hMSH2 and hMSH6 was compared.ResultsThere was no significant difference in the tumor characteristics of different parts.The rate of positive expression of hMLH1,hMSH2 and hMSH6 detected by in situ hybridization was significantly higher than that of immunohistochemistry,respectively (P<0.01).The immunohistochemistry result showed that there was no correlation between hMLH1 and hMSH2 expression,but hMLH1 or hMSH2 was positively correlated with hMSH6 expression,respectively.The expressions of hMLH1,HMSH2 and hMSH6 detected by in situ hybridization were positively correlated among the SCRC tumor tissues.ConclusionIn situ hybridization and immunohistochemistry are two best methods to evaluate the expression of three mismatch repair proteins hMLH1,hMSH2 and hMSH6 in postoperative neoadjuvant chemotherapy patients after rectal cancer.

in situ hybridization; immunohistochemistry; colorectal cancer; mismatch repair gene protein

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.010

2016-10-08；

2017-03-09

*通訊作者，E-mail：luojiaoxiuqa@sina.com.

R735.3

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秦旭平)