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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所、生理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.北京航天總醫(yī)院ICU；3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣西桂林；4.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校湖南株洲；5.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究所；6.南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

橘皮素對PC-12細(xì)胞Aβ水平的影響及機(jī)制研究

歐陽新平1，鄭莉2，周壽紅1，陸素青3，陳歆4，張敏5，何平平6*，唐朝克5*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所、生理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.北京航天總醫(yī)院ICU；3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣西桂林；4.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校湖南株洲；5.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究所；6.南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

目的觀察橘皮素對PC-12細(xì)胞β淀粉樣蛋白(Aβ)水平的影響并探討其可能的機(jī)制。方法不同濃度(0.1、1、10、100 μmol/L)的橘皮素，作用不同時(shí)間(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)處理PC-12細(xì)胞后，采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液Aβ40和Aβ42水平，Western blot檢測PC-12細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)蛋白水平，RT-PCR檢測PC-12細(xì)胞ABCA1 mRNA水平。ABCA1 SiRNA抑制ABCA1蛋白表達(dá)。結(jié)果10 μmol/L及100 μmol/L橘皮素組Aβ40和Aβ42水平顯著下降，ABCA1蛋白水平明顯增加，而所有組ABCA1 mRNA水平?jīng)]有改變。使用100μmol/L橘皮素處理PC-12細(xì)胞，處理后ABCA1 mRNA表達(dá)與對照組比較差異無顯著性，24 h及48 h組ABCA1水平顯著增加，Aβ40和Aβ42水平顯著下降。使用ABCA1 SiRNA抑制PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)后，ABCA1 siRNA處理組與對照組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著增加。結(jié)論橘皮素可通過增加ABCA1蛋白來降低PC-12細(xì)胞Aβ40和Aβ42水平。

橘皮素； PC12細(xì)胞； ABCA1； β淀粉樣蛋白； 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種在老年人群中發(fā)病率較高且危害性較大的一種神經(jīng)退行性疾病。目前研究表明，腦內(nèi)過量的β淀粉樣蛋白(β-Amyloid protein，Aβ)聚集形成老年斑，從而對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性并導(dǎo)致其變性死亡[1]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)是一種跨膜蛋白，其主要作用之一是維持細(xì)胞內(nèi)外膽固醇的動態(tài)平衡[2]。研究顯示，在ABCA1敲除小鼠其腦內(nèi)Aβ水平增加[3]，而ABCA1過表達(dá)小鼠則其腦Aβ水平減少[4-5]。因此，現(xiàn)在認(rèn)為ABCA1可作為治療AD的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)，因此尋找一種能有效上調(diào)ABCA1表達(dá)的物質(zhì)變得至關(guān)重要。橘皮素(Tangeretin)是中國傳統(tǒng)中藥材橘皮中所含的有效成分之一，屬于黃酮類化合物。大量研究表明黃酮類具有抑制細(xì)菌、抗腫瘤、抗病毒及抗氧化等廣泛的藥理作用，近年來研究表明同為黃酮類的花青素具有上調(diào)ABCA1蛋白的作用[6-7]，那是否橘皮素能通過增加ABCA1表達(dá)，進(jìn)而降低Aβ水平，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料和方法

1.1材料與試劑橘皮素購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自杭州四季清公司；兔抗鼠ABCA1、β-actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、小鼠特異性ABCA1小干擾RNA(SiRNA)購自Santa Cruz公司；Aβ40和Aβ42ELISA檢測試劑盒采購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購于芬蘭Finnzymes公司；其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC-12細(xì)胞由中山大學(xué)生理教研室提供，使用1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化后傳代。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，更換培養(yǎng)液，24 h加入1 640培養(yǎng)液(對照)或不同濃度(100 nmol/L 、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L)的橘皮素，作用不同時(shí)間(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)后分別收取上清液凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂肦IPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 rpm離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液至新EP管后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 將收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液離心(4 ℃，12 000 rpm，10 min)，取上清液。使用Aβ40或Aβ42試劑盒進(jìn)行測定，根據(jù)試劑盒說明書采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫法檢測樣本中Aβ40或Aβ42的水平。先把純化后的抗體包被在96孔板中，制成為固相抗體后，再將Aβ40或Aβ42抗原、生物素化的抗體以及HRP標(biāo)記的親和素依次加入含有包被抗體的孔中，然后采用底物TMB顯色，顏色的深淺和樣本中的Aβ40或Aβ42呈正向相關(guān)。隨后使用酶標(biāo)儀(設(shè)定450nm波長)測定每個(gè)樣本吸光度值(OD值)，最后計(jì)算出樣本的濃度。

1.4小干擾RNA轉(zhuǎn)染小鼠特異性ABCA1小干擾RNA(siRNA)由圣克魯斯生物技術(shù)公司提供。ABCA1 siRNA：sense 5′-GGAUUUUUUGCUCAGAUUGTT-3′，antisense 5′-CAAUCUGAGCAAAAAAUCCTT-3′。將PC-12細(xì)胞放入六孔板(2×106細(xì)胞/孔)24 h。使用脂質(zhì)體2000分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h。使用Western blot檢測ABCA1siRNA對相應(yīng)蛋白抑制效果。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot) 收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌2次，蛋白裂解液500 μL裂解細(xì)胞，冰上孵育30 min后，將樣本于4 ℃、15 000 rpm離心30 min，收集上清，即為細(xì)胞的總蛋白。采用BAC法測定蛋白含量。煮沸變性，上樣后進(jìn)行電泳，電壓為80 mV，在6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h分離蛋白質(zhì)。將分離的蛋白質(zhì)用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，10%脫脂牛奶室溫下封閉2～3 h或4 ℃封閉過夜，加入兔抗鼠β-actin(1∶200)、ABCA1(1∶200)一抗孵育4～6 h。使用TBST緩沖液洗膜10 min×3次，隨后加入二抗，孵育2～3 h，TBST緩沖液洗膜10 min×3次。顯影劑顯影后，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，并進(jìn)行半定量分析。

1.6 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time Quantitative PCR，Real-time PCR) 先提取PC-12細(xì)胞總RNA，然后使用SYBR綠色熒光測定試劑盒，采用Roche light Cycler Run 5.32 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR分析。合成小鼠ABCA1引物序列：5′-GGGTGAACGAGTTTCGGTATG-3′和5′-CTGAAGATGCTTGGCTTTGCT-3′。最后采用ΔΔCt方法進(jìn)行定量測定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。兩組間的比較采用Student’st檢驗(yàn)，三組或多組之間的比較采用one-way ANOVA分析。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異具有顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1橘皮素減少PC-12細(xì)胞Aβ40和Aβ42水平ELISA方法檢測PC-12細(xì)胞培養(yǎng)液Aβ40和Aβ42水平(Aβ由膜上剪切生成后進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)液)。結(jié)果顯示10 μmol/L、100 μmol/L組Aβ40和Aβ42水平顯著下降，且100 μmol/L組下降更明顯(圖1A，圖1B);24 h及48 h組Aβ40和Aβ42水平顯著下降(圖1C，圖1D)，說明橘皮素能減少PC-12細(xì)胞Aβ40和Aβ42水平。

圖1 橘皮素對PC-12細(xì)胞Aβ40及Aβ42水平的影響(n=3) 與對照組比較，*P<0.05

2.2橘皮素增加PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白水平Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示10μmol/L、100μmol/L橘皮素組與對照組相比，ABCA1蛋白水平明顯增加(圖2A)，而ABCA1 mRNA水平則沒有改變(圖2C);24 h及48 h組PC-12細(xì)胞ABCA1水平顯著增加(圖2B)，ABCA1 mRNA表達(dá)與對照組比較差異無顯著性(圖2D)，說明橘皮素增加PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白水平，但不影響ABCA1 mRNA水平。

2.3橘皮素通過PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白減少Aβ水平

2.3.1 ABCA1 siRNA抑制效果檢測 Western blot檢測ABCA1 siRNA 后PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白水平，結(jié)果顯示ABCA1 siRNA能有效抑制PC-12細(xì)胞ABCA1表達(dá)(圖3)。

2.3.2 橘皮素通過PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白減少Aβ水平 ELISA結(jié)果顯示橘皮素處理組與對照組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著下降。ABCA1 siRNA處理組與對照組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著增加。橘皮素+ABCA1 siRNA處理組與橘皮素處理組比較，Aβ40和Aβ42水平顯著增加(圖4)。說明橘皮素通過PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白減少Aβ40和Aβ42水平。

3 討 論

橘皮素屬于多甲氧基黃酮類(polymethoxylated flavones，PMFs)，研究證明其具有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗菌及降低膽固醇水平的功能[8-11]。近年來研究表明同為黃酮類的花青素具有上調(diào)ABCA1蛋白的作用[9]，那是否橘皮素能通過作用于ABCA1，進(jìn)而降低Aβ水平，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究中觀察橘皮素對PC-12細(xì)胞ABCA1及Aβ水平的影響。

沉積的Aβ是AD病變中老年斑的核心組成成分，它在AD這種神經(jīng)退行性疾病的病變過程中起關(guān)鍵作用[12-13]。在AD中，Aβ可以導(dǎo)致線粒體功能的破壞、氧化和應(yīng)激、破壞細(xì)胞膜的完整性以及損傷神經(jīng)軸突運(yùn)輸和突觸傳遞，最終引起神經(jīng)元的變性丟失[13]。在這些病理生理過程中，Aβ的產(chǎn)生是其中的關(guān)鍵步驟，因此，針對腦內(nèi)Aβ代謝的調(diào)節(jié)是治療AD的一種有效且至關(guān)重要的策略[14]。

圖2.橘皮素對PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白及mRNA的影響(n=3)

圖3 ABCA1 SiRNA對PC-12細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響

圖4 橘皮素通過PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白影響Aβ40及Aβ42水平(n=3)與對照組比較，*P<0.05；與橘皮素比較，#P<0.05，##P<0.01

我們研究結(jié)果表明橘皮素處理PC-12細(xì)胞24 h后，PC-12細(xì)胞培養(yǎng)液Aβ40和Aβ42水平顯著降低。說明橘皮素能降低Aβ40和Aβ42水平。

研究表明，一些參與AD病理過程的關(guān)鍵因子，例如膽固醇代謝異常會影響淀粉樣前體蛋白(β-Amyloid protein，APP)及β位淀粉樣前體蛋白分解酶1(beta-site APP cleaving enzyme 1，BACE1)的募集[14]。膽固醇代謝的異常和Aβ沉積都與AD的發(fā)生發(fā)展有非常密切的聯(lián)系，而且兩者經(jīng)常伴隨存在，另外膽固醇代謝的異常會增加Aβ沉積[15]。

ABCA1是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外膽固醇平衡的一個(gè)非常重要的因子。在腦內(nèi)，ABCA1可轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和磷脂流出細(xì)胞外到載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)，并且可以影響apoE的荷脂以及腦內(nèi)apoE水平。許多研究表明，ABCA1缺乏會增加Aβ水平。Koldamova等研究發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)APP的APP23和PDAPP模型小鼠中，敲除腦內(nèi)ABCA1水平可降低apoE荷脂和apoE水平，并增加腦內(nèi)Aβ40及Aβ42的水平[15]。腦內(nèi)ABCA1高表達(dá)則降低Aβ水平。研究發(fā)現(xiàn)使用促進(jìn)ABCA1高表達(dá)的人工合成藥物T0901317處理APP23轉(zhuǎn)基因小鼠，可以增加腦內(nèi)ABCA1蛋白表達(dá)并且顯著降低Aβ40和Aβ42的腦水平[15]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，使用ABCA1 siRNA削弱ABCA1蛋白表達(dá)后，PC-12細(xì)胞的Aβ40和Aβ42水平顯著增加。因此，ABCA1可以作為降低Aβ水平以及治療AD的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

我們使用橘皮素處理PC-12細(xì)胞24 h后，ABCA1蛋白水平明顯增加，而ABCA1 mRNA水平則沒有改變，說明橘皮素能增加ABCA1蛋白表達(dá)的同時(shí)降低Aβ40和Aβ42水平。隨后，使用ABCA1 siRNA抑制ABCA1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示橘皮素降低Aβ40和Aβ42水平的能力顯著減弱，說明橘皮素能通過增加ABCA1蛋白表達(dá)來降低Aβ40和Aβ42水平。因此，橘皮素有望對阿爾茨海默病的治療提供一個(gè)方向，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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TheinfluenceandmechanismresearchoftangeretinonthePC-12cellbetaamyloidproteinlevels

OUYANG Xinping，ZHENG Li，ZHOU Shouhong，et al

(DepartmentofPhysiology,TheNeuroscienceInstitute,MedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe the effect that the Tangeretin on the PC-12 cell beta Amyloid (Aβ) protein levels and discuss the possible mechanism.MethodsUsing different concentrations (0.1,1,10,100μmol/L) of the Tangeretin to treat PC-12 cells at different time (0h,6h,12h,24 h,48 h),the level of Aβ40and Aβ42inthe cell culture were detected by the method of ELISA,the levels of ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) protein in the PC-12 cells were detected by western blot,the levels of ABCA1 mRNA in the PC-12 cells were detected by RT-PCR.After using ABCA1 SiRNA to inhibit the expression of ABCA1 protein.ResultsAβ40and Aβ42levels decreased significantly in 10μmol/L and 100μmol/L Tangeretin group,ABCA1 protein level increased significantly,and ABCA1 mRNA level of all groups didn’t change.With the treatment of 100μmol/L Tangeretin on PC-12 cells,ABCA1 mRNA expression hadn’t significant difference compared with the control group,ABCA1 protein level of 24 h and 48 h group increased significantly,Aβ40and Aβ42levels decreased significantly.ConclusionThe Taneretin can reduce Aβ40and Aβ42levels through increasing ABCA1 protein level.

tangeretin;PC-12 cells;ABCA1;amyloid beta;alzheimer’s disease

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.003

2016-12-25；

2017-03-01

湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2014B393)；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目(201524)；南華大學(xué)校內(nèi)博士啟動基金(2014XQD36、2015XQD37)。

*通訊作者，E-Mail：tangchaoke@qq.com；E-Mail：hpp-612@163.com。

R741.05

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秦旭平)