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        免疫抑制劑血藥濃度兩種檢測方法對比分析

        2017-12-22 12:17:09王陸軍
        海軍醫(yī)學(xué)雜志 2017年6期
        關(guān)鍵詞:血藥濃度全血霉素

        王陸軍

        ·臨床醫(yī)學(xué)·

        ·論著·

        免疫抑制劑血藥濃度兩種檢測方法對比分析

        王陸軍

        目的采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)監(jiān)測2種免疫抑制劑普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素血藥濃度,比較CMIA與酶增強(qiáng)免疫(EMIT)2種方法之間的相關(guān)性。方法將檢測對象按測定項目分別用EMIT和CMIA同時進(jìn)行檢測,以EMIT法為基準(zhǔn)進(jìn)行配對t檢驗和相關(guān)性分析。結(jié)果普樂可復(fù)2種方法相關(guān)性r=0.982(P<0.05),檢測結(jié)果偏差為-0.71 μg/L(95%可信區(qū)間:-0.91~-0.50 μg/L),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);環(huán)孢霉素2種方法相關(guān)性r=0.976(P<0.05),檢測結(jié)果偏差為0.57 μg/L(95%可信區(qū)間:0.37~0.77 μg/L),差異有統(tǒng)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CMIA和EMIT均可對該2種免疫抑制劑治療藥物進(jìn)行濃度檢測,二者之間有良好的相關(guān)性,但患者要建立各自新的治療窗范圍。

        普樂可復(fù);環(huán)孢霉素;化學(xué)發(fā)光微粒子免疫;酶增強(qiáng)免疫

        普樂可復(fù)(tacrolimus)、環(huán)孢霉素(cyclosporine)是器官移植手術(shù)后和自身免疫性疾病常用的免疫抑制劑。二者均有治療窗窄,藥代動力學(xué)差異大等特點,臨床使用過程中需經(jīng)常監(jiān)測血藥濃度[1-3]。近幾年臨床普遍采用重組葡萄糖-6-磷酸脫氫酶增強(qiáng)免疫法(EMIT)檢測2種藥物的血藥濃度[4-5];近年美國雅培體外診斷有限公司推出了基于化學(xué)發(fā)光微粒子的免疫分析技術(shù)(CMIA),應(yīng)用于ARCHI-TECTi2000或i1000系統(tǒng)的tacrolimus和cyclosporine檢測試劑盒,代替了重組葡萄糖-6-磷酸脫氫酶增強(qiáng)免疫分析法對2種治療藥物進(jìn)行監(jiān)測。通過檢測78例次肝移植和/或腎移植患者全血普樂可復(fù)和52例次環(huán)孢霉素的濃度,比較CMIA與EMIT之間的偏差及相關(guān)性?,F(xiàn)報道如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        因各自的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品都適用于各自的檢測體系無可比性,通用的質(zhì)控品難以購買,所以采用本實驗室的130例次臨床樣本進(jìn)行對比分析,130例次臨床樣本均來自肝移植和/或腎移植患者,標(biāo)本采集多為口服相應(yīng)藥前30 min或口服相應(yīng)藥120 min后,分別抽取2 ml靜脈血,注入EDTA抗凝的血常規(guī)管內(nèi),顛倒混勻2~3次,所有樣本均采用全血于當(dāng)日檢測。因本研究是采用自身配對比較,測定中病例的選擇、給藥的方式方法、移植類型、移植時間等因素不會或較小影響2種測定方法的結(jié)果,因而未進(jìn)一步進(jìn)行影響因素分析。

        1.2 儀器與試劑

        CIMA法:采用美國雅培體外診斷生物有限公司生產(chǎn)的Architect i2000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、配套的Tacrolimus和Cyclosporine試劑盒及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本前處理試劑;EMIT法:采用德國西門子公司生產(chǎn)的SYVA Viva-E臨床化學(xué)分析儀(簡稱SYVA Viva-E)、配套的Tacrolimus、Cyclosporine試劑盒及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本前處理試劑。G16型醫(yī)用高速臺式離心機(jī),由河北省安新白洋離心機(jī)生產(chǎn)提供,XH-C型漩渦混合器,由江蘇省金壇金偉實驗儀器廠生產(chǎn)提供。50~250 μl、100~1 000 μl加樣器由上海狄氏醫(yī)療器械有限公司提供。

        1.3 檢測方法

        1.3.1 EMIT法 測試前開機(jī),按照儀器操作規(guī)定常規(guī)進(jìn)行日常保養(yǎng)。用配套的標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)后,每次測試用MODE 1標(biāo)準(zhǔn)品對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比或校正,常規(guī)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。所有試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)量控制品和臨床樣本均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作:4 ℃冰箱取出各種試劑后平衡至室溫,試劑盒放入儀器試劑槽內(nèi),Tacrolimus加200 μl 全血樣本于1.5 ml離心管,然后加入200 μl甲醇,再加50 μl樣本前處理液,充分渦旋混勻,13 000 r/min(r=8 cm)高速離心6 min后,立即將上清液按順序倒入樣品杯,置于樣品架子后立即上機(jī)測試。30 min后自動打印測試結(jié)果,所有質(zhì)控品全部在控。Cyclosporine加100 μl 全血樣本于1.5 ml離心管,然后加300 μl環(huán)孢霉素樣本預(yù)處理試劑,充分渦旋混勻,13 000 r/min高速離心6 min后,同樣立即將上清液按順序倒入樣品杯,置于樣品架子后立即上機(jī)測試。30 min后自動打印測試結(jié)果,所有質(zhì)控品全部在控。

        1.3.2 CMIA法 該儀器開機(jī)后24 h運(yùn)轉(zhuǎn),按照儀器操作規(guī)定常規(guī)進(jìn)行日常保養(yǎng),放置試劑于儀器試劑倉內(nèi),用配套標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)。所有標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和臨床樣品均嚴(yán)格按說明進(jìn)行操作:Tacrolimus加200 μl全血樣品于1.5 ml離心管,然后加入200 μl全血沉淀劑,充分渦旋混勻,13 000 r/min(r=8 cm)高速離心5 min,上清液按順序倒入移植預(yù)處理管,置于急診樣品架上機(jī)立即測定,30 min后測試結(jié)果自動傳送至中文處理系統(tǒng)。Cyclosporine測定加200 μl全血樣品于1.5 ml離心管,然后加入100 μl全血溶解劑,再加400 μl環(huán)保霉素全血沉淀劑,充分渦旋混勻,13 000 r/min高速離心5 min,上清液按順序倒入移植預(yù)處理管,置于急診樣品架上機(jī)立即測定,30 min后測試結(jié)果自動傳送至中文處理系統(tǒng)。

        1.3.3 臨床樣本分組 根據(jù)Architect i2000對普樂可復(fù)檢測體系的檢測結(jié)果,將普樂可復(fù)濃度小于3.0 μg/L的16例樣本設(shè)置為低濃度組;在3.0~<14.0 μg/L之間的43例樣本設(shè)置為中濃度組;大于14.0 μg/L的19例樣本設(shè)置為高濃度組。根據(jù)Architect i2000對環(huán)孢霉素檢測體系的檢測結(jié)果,將環(huán)孢霉素濃度小于80.0 μg/L的9例樣本設(shè)置為低濃度組;在80.0~<300 μg/L之間的32例樣本設(shè)置為中濃度組;大于300 μg/L的11例樣本設(shè)置為高濃度組。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

        根據(jù)Architect i2000與SYVA Viva-E對普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素的檢測結(jié)果,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,同種藥物2種方法檢測結(jié)果采用配對t檢驗,相關(guān)性采用直線回歸分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 2種方法檢測78例次患者樣本tacrolimus結(jié)果

        2種方法的檢測結(jié)果比較見表1。由表1可知,在低濃度組CMIA法檢測tacrolimus水平顯著低于EMIT法(P<0.05),而在中濃度和高濃度組CMIA法檢測tacrolimus水平雖低于EMIT法,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        2.2 2種方法檢測52例次患者樣本cyclosporine結(jié)果

        2種方法檢測結(jié)果比較見表2。低、中、高2濃度組的52例次患者樣本cyclosporine檢測結(jié)果,CMIA法均低于EMIT法,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

        表1 2種方法檢測78例次患者樣本tacrolimus結(jié)果比較(x±s)

        注:CMIA:化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析技術(shù),EMIT:酶增強(qiáng)免疫法

        表2 2種方法檢測52例次患者樣本cyclosporine結(jié)果比較(x±s)

        注:CMIA:化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析技術(shù),EMIT:酶增強(qiáng)免疫法

        2.3 比對結(jié)果

        分別對78例次普樂可復(fù)和52例次環(huán)孢霉素樣本檢測結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)比對及回歸分析,2種方法檢測tacrolimus結(jié)果的相關(guān)性r=0.982(P<0.05);檢測cyclosporine結(jié)果的相關(guān)性r=0.976(P<0.05),均具有顯著的相關(guān)性。

        3 討論

        3.1 普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素濃度監(jiān)測的重要性

        普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素是2種高效免疫抑制藥,臨床上廣泛應(yīng)用于預(yù)防器官移植的排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療[5]。2種藥物在藥動學(xué)和藥效學(xué)上又存在著明顯的個體差異,且都具有治療的窗口范圍較窄、藥物之間具有復(fù)雜的相互作用、給藥劑量與血藥濃度具有顯著的相關(guān)性不佳等特點。因此,臨床必須不斷根據(jù)患者體內(nèi)藥物監(jiān)測結(jié)果適時調(diào)整用藥劑量,真正實施個體化給藥,這樣對減少移植物排斥反應(yīng)發(fā)生的頻次、減少免疫抑制劑的不良反應(yīng)及改善移植物長期生存率具有非常重要的臨床意義[6-7]。

        3.2 EMIT和CMIA法的測定原理

        用于生物樣本內(nèi)普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素2種免疫抑制劑的定量分析法,主要有免疫分析和色譜分析,其中免疫分析主要包括放射受體分析法、放射免疫法、熒光偏振免疫分析、ELISA法、EMIT法、化學(xué)發(fā)光法(CL)和CMIA等[8-9]。色譜分析目前主要有液相色譜和氣相色譜。不同的方法對樣本提取的過程不同,對代謝物的識別亦不同,因此所得的結(jié)果也不相同。CMIA測定原理是用吖啶脂標(biāo)記藥物分子作為競爭物,用相應(yīng)普樂可復(fù)或環(huán)孢霉素單克隆抗體包被的順磁微珠作為捕獲物,將處理完的樣品與包被的單克隆抗體的順磁微珠混合反應(yīng),然后加入吖啶脂標(biāo)記的相應(yīng)藥物分子,共同競爭磁微珠上的藥物抗體空位,然后外加磁場使磁微珠分離,清洗后加入預(yù)激發(fā)液與激發(fā)液試劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度與樣品中的藥物濃度成反比,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可求得樣品中普樂可復(fù)或環(huán)孢霉素的濃度。而SYVA Viva-E是根據(jù)抗原抗體結(jié)合后酶活性的多少計算藥物濃度。SYVA Viva-E的檢測原理是將樣本中被測藥物與酶試劑中標(biāo)記有重組酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(rG6PDH)的藥物競爭,活性(游離)的rG6PDH將抗體試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),致使動態(tài)吸光度改變,計算出其濃度。

        3.3 2種檢測體系的結(jié)果分析

        實驗結(jié)果表明,CMIA藥物濃度測定操作系統(tǒng)的智能化自動化程度高[10],普樂可復(fù)和環(huán)孢霉檢測的精密度分別為0.3 μg/L和4.7 μg/L,檢測范圍分別為0~30 μg/L和0~1 500 μg/L,線性范圍分別為0.9~30 μg/L和11.7~1 500 μg/L。而EMIT法檢測血普樂可復(fù)和環(huán)孢霉檢測的精密度分別為0.6 μg/L和10.6 μg/L,檢測范圍分別為0~30 μg/L和0~1 000 μg/L,線性范圍分別為2.0~30 μg/L和40~1 000 μg/L,2者之間有顯著差異。在對ARCHITECT i2000系統(tǒng)檢測2種血藥濃度初步評價和分析性能驗證[11]的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)行了該項比對實驗及相關(guān)性分析。表1和表2顯示2種檢測方法檢測對該2種藥物濃度的檢測結(jié)果都有差異,CMIA 在檢測普樂可復(fù)濃度時結(jié)果低于 EMIT法,在低濃度時有顯著差異,而在中濃度和高濃度時雖有降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,CMIA在檢測環(huán)孢霉素時3組均低于EMIT法,且有顯著差異,但2種方法具有較高的相關(guān)性。其CMIA法檢測普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素的結(jié)果低于EMIT法,可能與其代謝產(chǎn)物的交叉反應(yīng)率要比EMIT 低有關(guān),其抗體特異性比EMIT要高,所以CMIA系統(tǒng)測試結(jié)果普遍低于EMIT系統(tǒng)測試結(jié)果,即系統(tǒng)偏差。由此可以看出,方法學(xué)的不同及與代謝產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)的非特異性是產(chǎn)生偏倚的主要原因[12]。多項研究表明,CMIA試劑盒在檢測全血普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素濃度時,有非常好的效果[10-13]。

        3.4 臨床使用性及推廣應(yīng)用

        雖然色譜分析的結(jié)果較為準(zhǔn)確,但臨床難以推廣。ARCHITECT i2000檢測系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種高靈敏度的檢測方法,至于其檢測結(jié)果與EMIT 法檢測結(jié)果的相關(guān)性如何,是我們要提供給臨床醫(yī)師調(diào)整用藥的關(guān)健參考依據(jù)?;谝陨戏治黾氨緳z測結(jié)果,我們認(rèn)為可以選擇CMIA法和EMIT法進(jìn)行普樂可復(fù)和環(huán)孢霉素治療藥物的檢測。因其自動化程度高、樣本用量少,樣本預(yù)處理簡單、快速,測定結(jié)果與臨床符合程度較好,并且適用急診和大樣本分析測定等優(yōu)點,現(xiàn)國內(nèi)應(yīng)用較多。因2種方法的檢測結(jié)果存在偏倚,故臨床醫(yī)師對2種方法的檢測結(jié)果之間不應(yīng)直接比較,并且各個實驗室得到的結(jié)果也可能會存在差異,這可能給臨床醫(yī)師的治療帶來一定的困惑[14]。所以作者認(rèn)為,由于臨床狀態(tài)的復(fù)雜性,建議患者連續(xù)使用同一種檢測方法,或者是連續(xù)在同一個實驗室檢測,醫(yī)師應(yīng)根據(jù)患者情況及臨床經(jīng)驗確立患者的血藥濃度范圍,以便合理有效地調(diào)整該2種免疫抑制劑用量,避免或減少排斥反應(yīng)和藥物不良反應(yīng)的發(fā)生[14-15]。

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        Comparison and analysis of two different detection methods for blood concentration levels of immunosuppressant

        WangLujun

        (TraditionalChineseMedicineHospital,LingchengDistrict,DezhouCity,Dezhou253500,China)

        ObjectiveTo investigate the sensitivity of chemoluminescent micro-particle immunoassay (CMIA) and enzyme multiplied immunoassay (EMIT) for the detection of blood drug concentration levels of tacrolimus and cyclosporine, and analyze the relationship between the CMIA and EMIT methods.MethodsIn accordance with measuring items, the 2 immunosuppressant agents were detected simultaneously by EMIT and CMIA. EMIT method was used as a detection standard for pairt-test and correlation analysis.ResultsThe correlation between the 2 detection methods for tacrolimus wasr=0.982 (P<0.05), and the deviation of the detected results was -0.71 μg/L (95% confidential interval: -0.91~-0.50μg/L), and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them (P<0.05). The correlation between the 2 detection methods for cyclosporine wasr=0.976 (P<0.05), and the deviation of the detected results was 0.57μg/L(95% confidential interval: 0.37~0.77μg/L), and statistical significance could also be found, when comparisons were made between them (P<0.05).ConclusionCMIA and EMIT could all be used for the detection of these 2 immunosuppressant agents, and there was good correlation between these 2 detection methods. However, their own range of therapeutic window should be established for the patients, when CMIA was used.

        Tacrolimus; Cyclosporine; Chemoluminescent micro-particle immunoassay; Enzyme multiplied immunoassay

        R446.1

        A

        10.3969/j.issn.1009-0754.2017.06.021

        253500 山東 德州,德州市陵城區(qū)中醫(yī)院

        2017-09-28)

        (本文編輯:彭潤松)

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