巴音額古樂 金鴻賓

(1．內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.天津醫(yī)院，天津 300211)

實驗研究

蒙藥藍刺頭對骨折愈合過程中BMP-2及VEGF表達影響△

巴音額古樂1金鴻賓2

(1．內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.天津醫(yī)院，天津 300211)

目的：觀察蒙藥藍刺頭對骨折愈合過程中BMP-2、VEGF表達的影響，初步探討蒙藥藍刺頭對骨折愈合影響及其作用機制。方法選用健康成年日本大耳白兔75只，制作雙側(cè)橈骨中段骨折模型。實驗隨機分為模型組，陽性對照骨碎補組(0.3g. kg-1)，蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組(3g. kg-1、1.5 g. kg-1、0.3g. kg-1)，藥物摻入飼料，于造模后第1天連續(xù)給藥8wk。分別于骨折后第 2、4、8wk時處死，并取材進行免疫組化染色，通過組織學及免疫組化法檢測骨折部位BMP-2 、VEGF的陽性表達，進行陽性細胞平均光密度( MOD) 值分析。結(jié)果測定各組骨外膜BMP-2 表達陽性的 MOD 值，各組間比較顯示：干預 2wk時蒙藥高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4 wk時蒙藥高劑量組與模型組、蒙藥中劑量組、骨碎補組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且蒙藥中劑量組、骨碎補組與模型組比較也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；8 wk時各組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。測定各組骨內(nèi)膜處 BMP-2 表達陽性的 MOD 值， 各組間比較顯示： 2 wk時蒙藥高、中劑量組與蒙藥低劑量組、模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且蒙藥高劑量組與蒙藥中劑量組、骨碎補組比較也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第 4 wk時蒙藥高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第 8 wk時蒙藥高、中劑量組及骨碎補組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。測定各組骨外膜處 VEGF表達陽性的 MOD 值， 各組間比較顯示： 2 、4wk時蒙藥高劑量組與模型組、蒙藥低劑量組比較具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；8 wk時各組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。測定各組骨內(nèi)膜 VEGF 表達陽性的MOD 值，各組間比較顯示：在第 2 、 4 wk時蒙藥高、中劑量組及骨碎補組與模型組、蒙藥低劑量組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；8wk時各組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論蒙藥藍刺頭對骨折愈合具有一定的促進作用，能夠提高BMP-2、VEGF的表達，其機制可能是促進成骨細胞活性及提高骨生長因子BMP-2 和 VEGF的表達有關。

蒙藥藍刺頭；骨折愈合；BMP-2；VEGF；成骨細胞

蒙醫(yī)在治療前臂骨折、骨不愈合、骨折較輕而筋傷較寬等情況時，慣用內(nèi)服藍刺頭水煎劑，均有很好的治療效果。當前，藍刺頭化學組分研究主要集中在脂溶性成分，包括生物堿、黃酮類、三萜及噻吩類化合物等[1]。劉巖等[2]通過動物實驗研究蒙藥藍刺頭對骨代謝性疾病作用影響結(jié)果表明，蒙藥藍刺頭具有類雌激素樣的促進骨形成和抑制骨吸收作用。然而，蒙藥藍刺頭對骨折愈合過程中骨生長因子的影響作用機制方面的研究尚未見有報道。本實驗擬制作兔橈骨骨折模型，觀察蒙藥藍刺頭干預骨折愈合過程中對骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達影響，探討蒙藥藍刺頭對骨折愈合影響及其部分作用機制，為臨床提供理論與實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：健康日本大耳白兔共75只，體重 2.0kg～2.5 kg，12wk齡，其中雌性38只，雄性37只，由天津市骨科研究所動物實驗室提供，動物模型建立、飼養(yǎng)和取材均在天津市骨科研究所動物實驗進行。

1.2 藥品和試劑：藍刺頭(花序)，河北保定安國藥材市場購買；骨碎補，天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房購買；鹽酸賽拉嗪注射液(速眠新Ⅱ號)，吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司；兔IgG免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；顯色試劑盒(DAB)，武漢博士德有限公司； VEGF免疫組化試劑盒，武漢博士德有限公司；BMP-2免疫組化試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；防脫載玻片，江蘇世泰實驗器材有限公司；蘇木素、伊紅，天津市永大化學試劑開發(fā)中心。

1.3 儀器：南韓牙科臺式鉆N3/E102N3，佛山市多易美醫(yī)療器材有限公司；高速萬能粉碎機YJ-1000A，濟南億健醫(yī)療設備有限公司；超低溫冰箱DW-86L486，青島海爾特種電器有限公司；切片機RM2255 ，德國 LEICA 公司；自動雙重純水蒸餾器SZ-93，上海徐新生化儀器廠；制冰機AF200-PSC50R，日本 SANYO 公司；多功能顯微鏡AX-80，日本 Olympus 公司；恒溫干燥箱(電熱)202，山東省濰坊醫(yī)療器械廠。

2 實驗方法

2.1 蒙藥藍刺頭制備：蒙藥藍刺頭原材料由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中提供，原材料為藍刺頭花序，共10kg。將其原材料在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院蒙藥炮制中心用小型萬能粉碎機打磨成粉末狀(過80目)，并封裝成袋，作為實驗藥品備用。

2.2 骨折模型建立：模型建立參照文獻[3]，將動物分籠適應性飼養(yǎng)2wk，手術當日將每只兔稱重后可用速眠新Ⅱ號(鹽酸塞拉嗪注射液)肌肉注射麻醉(肌注部位：臀肌處，肌注劑量：0.15mL·kg-1體重)，待麻醉后雙上肢常規(guī)脫毛，實施無菌手術，于雙側(cè)橈骨中1/3處縱行切開皮膚及皮下組織，暴露雙側(cè)橈骨中1/3部位，用口腔專用磨鉆造成3mm完全橫斷骨折，不作任何固定，生理鹽水沖洗切口，逐層縫合切口。術后分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼料及飲水。術后連續(xù)3d肌肉注射硫酸慶大霉素預防感染， 4萬U/次， 1次/d，每日觀察動物活動及創(chuàng)口愈合情況。

2.3 動物分組和給藥:將75 只日本大耳白兔，隨機數(shù)字表法分為5組：模型組，蒙藥高、中、低劑量組和陽性對照骨碎補組，每組 15只。每組再隨機分成3個小組，分別為2wk組、4 wk組、8 wk組，每組 5只，編號，分籠飼養(yǎng)。各組兔術后均常規(guī)飼養(yǎng)，給藥劑量按《人兔體表面積折算的等效劑量比值表》計算，術后d1開始給予飼料混合喂養(yǎng)不同劑量的蒙藥藍刺頭粉劑(高、中、低劑量組，依次為3g﹒kg-1、1.5g﹒kg-1、0.3g﹒kg-1，其低劑量組為臨床等效劑量，高、中、低劑量比例為10:5:1)1次/d，骨碎補組以臨床等效劑量0.3g﹒kg-1灌胃，1次/d，模型組灌胃等量蒸餾水1次/d。

2.4 標本留取： 分別于術后 2、4、8 wk，每個實驗組(5組)隨機抽取5只大耳朵白兔，并進行耳緣性空氣處死。在無菌條件下取出雙側(cè)尺橈骨，沿骨折斷端為中心，缺損區(qū)邊緣7.5 mm處截骨(長約15～16mm)，放入中性甲醛內(nèi)固定 7d。取右側(cè)橈骨標本為研究對象，若骨折位置移位明顯或出現(xiàn)骨折處感染等情況時選擇取對側(cè)橈骨標本為主。將標本放入10%的EDTA脫鈣液中脫鈣30d(脫鈣期間7d換1次脫鈣液)，待骨組織較松軟時即為達到脫鈣標準。

2.5 標本切片制作：脫鈣標本矢狀位剖開后進行脫水、透明、浸蠟、包埋(同HE染色標本的脫水、透明、浸蠟、包埋過程)等程序，用切片機制成4μm厚蠟片，將各組標本蠟片展于載玻片上并相應切片標碼后放入烤箱內(nèi)，在42℃條件下烤片48h后取出。

2.6 BMP-2、VEGF表達檢測：使用北京博奧森生物技術有限公司的BMP-2試劑盒和武漢博士德有限公司的VEGF試劑盒，按照試劑盒說明書要求，進行標本的BMP-2和VEGF表達檢測，觀察骨折愈合不同時間點骨外膜、骨內(nèi)膜BMP-2與VEGF的表達情況。

2.7 染色結(jié)果分析：通過染色后可見細胞漿變?yōu)樽厣蜃攸S色為BMP-2、VEGF表達陽性，未顯棕色或棕黃色為BMP-2、VEGF表達陰性，陰性對照片所有組織均未顯色。

2.8 免疫組化染色圖像分析：應用顯微圖像采集系統(tǒng)對免疫組化切片進行圖像采集，以骨折中心部位及wk圍組織處各取2個高倍鏡視野，采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件對骨BMP-2與VEGF表達陽性細胞進行平均光密度( MOD) 測定。

2.9 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用(±S)表示，采重復測量資料的方差分析(Repeated ANOVA)。數(shù)據(jù)滿足方差齊性的，組內(nèi)兩兩比較采用S-N-K法。不滿足方差齊性的采用調(diào)整水準的Dunnett3法。設定檢驗水準α=0.05，取雙側(cè)曲線下面積，P<0.05有統(tǒng)計學差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 骨折愈合不同時間點BMP-2表達結(jié)果：各組骨痂組織中均可見軟骨細胞、成纖維細胞、骨原細胞和骨小梁中的骨細胞胞漿中有陽性表達，各組間的不同時間點的表達陽性的細胞類別大致一樣，但表達的強弱卻不一樣，早期以骨原細胞、骨小梁中的骨細胞及骨痂外wk的幼稚軟骨細胞表達為主，后期以骨母細胞表達為主，各期蒙藥高、中劑量組與骨碎補組胞漿著色深度顯著于蒙藥低劑量組和模型組。測定各組骨外膜 BMP-2表達的 MOD 值，各組間比較顯示：干預骨折2wk時蒙藥高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4wk時蒙藥高劑量組與蒙藥低劑量組比較有顯著性差異(P<0.01)，且與模型組、蒙藥中劑量組、骨碎補組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，蒙藥中劑量組、骨碎補組與蒙藥低劑量組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；8wk時各組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。測定各組內(nèi)骨膜 BMP-2表達的 MOD 值，各組間比較顯示： 2wk時蒙藥高中劑量組、骨碎補組與模型組、蒙藥低劑量組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且蒙藥高劑量組與蒙藥高劑量組、骨碎補組比較也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4wk時蒙藥高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；8wk時蒙藥高中劑量組、骨碎補組與模型組、蒙藥低劑量組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組各期骨外膜BMP-2表達的MOD值

注：與模型組比較 *P<0.05，與蒙藥低劑量組比較 #P<0.01；與蒙藥中劑量組比較，☆P<0.05；與骨碎補組比較，◇P<0.05.

表2 各組各期骨內(nèi)膜BMP-2表達的MOD值

注：與模型組比較 *P<0.05，與蒙藥低劑量組比較 #P<0.01；與蒙藥中劑量組比較，☆P<0.05；與骨碎補組比較，◇P<0.05.

3.2 骨折愈合不同時間點VEGF表達結(jié)果：各組骨痂組織中成纖維細胞、軟骨細胞、骨母細胞均可見有陽性表達，各組間的不同時間點的表達陽性的細胞類別大致一樣，但表達的強弱卻不一樣。測定各組骨外膜處VEGF表達的 MOD 值，各組間比較顯示：2wk時蒙藥高劑量組、骨碎補組與模型組、蒙藥低劑量組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4wk時蒙藥高劑量組與模型組、蒙藥低劑量組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；8wk時各組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。測定各組骨內(nèi)膜處VEGF表達的 MOD 值，各組間比較顯示：在第2wk、4wk時蒙藥高中劑量組、骨碎補組與模型組、蒙藥低劑量組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；8wk時各組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組各期骨外膜VEGF表達的MOD值

注：與模型組比較 *P<0.05，與蒙藥低劑量組比較 #P<0.01；與蒙藥中劑量組比較，☆P<0.05；與骨碎補組比較，◇P<0.05.

表4 各組各期骨內(nèi)膜VEGF表達的MOD值

注：與模型組比較 *P<0.05，與蒙藥低劑量組比較 #P<0.01；與蒙藥中劑量組比較，☆P<0.05；與骨碎補組比較，◇P<0.05.

4 討論

蒙藥藍刺頭為常用接骨蒙藥之一，具有固骨折，接骨愈傷，清熱止痛的功效[4]。其味苦，性涼、稀、輕、柔、鈍。系菊科植物藍刺頭(Echinops lotifolis Tausch)的干燥復頭狀花序，多年本草[5]。始載于《智慧之劍》中, 屬于蒙醫(yī)自采自用藥之一，近代蒙醫(yī)藥學文獻《認藥白晶鑒》中均以阿扎格-刺日敖恩作為烏日格蘇圖-呼和(藍刺頭)收載[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，藍刺頭全草含黃酮類化合物，花序含量最高。

當骨組織未受到組織形態(tài)改變時BMP-2處于靜止態(tài)勢，一旦發(fā)生骨折，由于骨組織環(huán)境的改變，會立即激活BMP-2的活性，使BMP-2的活性增強，數(shù)量迅速增加，并誘導大量的新骨形成而促進骨組織修復。因此，BMP-2是一類具有潛在的活性糖蛋白，其對軟骨內(nèi)骨化還是膜內(nèi)成骨形成都有一定的促進作用[8]，是通過誘導間充質(zhì)干細胞分裂、增殖，轉(zhuǎn)化為成骨細胞或軟骨細胞后而進行成骨，骨髓間充質(zhì)干細胞在骨折局部被激活的BMP-2的誘導下有方向性遷徒，經(jīng)過一系列的分裂、增殖和分化等過程，轉(zhuǎn)化為軟骨細胞或成骨細胞，進一步形成軟骨和骨組織[9]。通過本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2在骨折修復階段，每個組骨痂wk圍的成纖維細胞及骨痂內(nèi)的軟骨細胞、骨母細胞、骨小梁中的骨細胞胞漿中均有陽性表達，不同時間點各組間陽性表達的細胞種類大體一樣，但表達強度有所差別，伴隨骨折修復中的組織學改變，早期主要在骨母細胞、骨細胞(骨小梁內(nèi)的)和幼稚軟骨細胞(骨痂外圍處的)中表達陽性，中后期主要在成骨細胞中表達陽性，各個時間段的蒙藥高中劑量組、骨碎補組的細胞胞漿顯色度顯著深于模型組、蒙藥低劑量組。研究表明[10]，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在骨和骨膜中成骨能力最強，而骨膜是產(chǎn)生新生骨的主要部位，具有向成骨細胞分化的功能[11,12]，故檢測了骨折處的骨外模和骨內(nèi)模BMP-2表達的MOD值。實驗結(jié)果顯示，蒙藥組和中藥組具有促進骨痂、骨外膜、骨內(nèi)膜BMP-2的表達作用，以骨折早中期(第2、4wk)為顯著，其中蒙藥高劑量組對促進骨外膜、骨內(nèi)膜成骨細胞表達作用最強，蒙藥中劑量組、骨碎補組、蒙藥低劑量組均高于模型組，并且蒙藥高劑量組對后期(第8wk)骨內(nèi)膜的BMP-2的表達也比其它組顯著，說明蒙藥藍刺頭高劑量組對后期提高膜內(nèi)成骨能力也較顯著。本次實驗證實了蒙藥藍刺頭接骨愈傷作用，可能一定程度上早期提高了成骨能力及BMP-2的表達，加快了骨痂形成及改建，促進骨折愈合。骨折愈合過程中有多種細胞因子、生長因子及其細胞外基質(zhì)在內(nèi)的協(xié)同作用下促使骨折斷端愈合，但骨折斷端早期微血管形成是骨折愈合過程中的最主要的前提，VEGF作為血管生成強效生長因子之一，在骨折愈合過程中起著極為重要作用，其主要通過旁分泌或自分泌而與相應受體相結(jié)合，并誘導體內(nèi)新生血管的生成，增加血管通透性，促使骨折端供氧，加速新陳代謝，提供有效的營養(yǎng)成分，為骨折斷端修復創(chuàng)造了有利的條件，并促使骨折愈合。通過本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在骨折愈合過程中，各組骨痂組織中成纖維細胞、軟骨細胞、骨母細胞均可見有陽性表達，早期以軟骨細胞、纖維細胞、骨母細胞陽性表達為主，中后期以骨母細胞、骨細胞及部分髓腔內(nèi)脂肪細胞陽性表達為主。骨折斷端早期微血管形成是骨折愈合的最主要的前提，骨膜含豐富的微血管，并有成骨細胞和未分化的間充質(zhì)干細胞等參與膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨過程[13]。本次實驗結(jié)果表明，只有蒙藥高劑量組在骨折愈合早中期(第2、4wk)具有促進骨外膜、骨內(nèi)膜VEGF的表達作用，并表達作用為最強。說明蒙藥藍刺頭促進VEGF的表達強度存在一定的量-效關系。本次實驗初步證實了蒙藥藍刺頭早期也能促進VEGF的表達，可能在一定程度上早期提高VEGF的表達，誘導體內(nèi)新生血管的生成而促進骨折愈合。

總之，蒙藥藍刺頭對骨折愈合具有一定的促進作用，其機制可能是促進成骨細胞合成及提高骨生長子 BMP-2 和 VEGF的表達有關。但是，蒙藥藍刺頭對骨折愈合影響相關作用機制的物質(zhì)基礎、細胞通路方面研究還有待于進一步深入研究。

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內(nèi)蒙古自然科學基金( 2015MS08131)

R291.2

A

1006-6810(2017)06-0053-04

2017年1月9日收稿