楊林青 孫穎川

(許昌學(xué)院，許昌 461000)

miR-128調(diào)控AK2蛋白的表達(dá)通過STAT3信號通路對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響①

楊林青 孫穎川

(許昌學(xué)院，許昌 461000)

目的探討miR-128調(diào)控AK2蛋白的表達(dá)通過STAT3信號通路對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響其機制。方法qPCR和Western blot檢測宮頸癌組織和細(xì)胞中AK2和miR-128的表達(dá)情況；雙熒光素酶實驗檢測miR-128和AK2之間的相互作用；CCK-8增殖試驗檢測miR-128對宮頸癌細(xì)胞增值能力的影響；裸鼠體內(nèi)成瘤試驗檢測miR-128對宮頸癌細(xì)胞成瘤能力的影響；Western blot檢測miR-128對STAT3信號通路蛋白水平的影響；Western blot檢測過表達(dá)AK2蛋白逆轉(zhuǎn)miR-128對p-STAT3的抑制水平。結(jié)果在宮頸癌組織中AK2表達(dá)水平相比正常宮頸組織中高，miR-128在宮頸癌C33a細(xì)胞株中表達(dá)水平較低；雙熒光素酶試驗證實miR-128可以直接靶向調(diào)控AK2的表達(dá)；CCK-8增殖實驗表明miR-128可以抑制宮頸癌細(xì)胞株的增殖能力；體內(nèi)成瘤實驗表明miR-128的增高可以抑制宮頸癌細(xì)胞成瘤能力[體積(3.05±0.35)cm3vs (0.86±0.11)cm3，P=0.031；(3.26±0.39)g vs (0.89±0.15)g，P=0.016]；Western blot實驗表明miR-128可以抑制p-STAT的激活[(42.12±6.28)% vs (91.25±9.29)%，P<0.05]，而AK2的過表達(dá)又可以逆轉(zhuǎn)miR-128對p-STAT的抑制作用。結(jié)論miR-128靶向調(diào)控AK2的表達(dá)進(jìn)而通過STAT3通路的激活調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

miR-128；宮頸癌；AK2；CCK-8

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤之一，僅次于卵巢癌，盡管目前早期檢測手段多樣，早期發(fā)現(xiàn)率有明顯的提高，但是總體發(fā)病率和術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然不佳，仍是對女性的生命健康嚴(yán)重威脅的疾病[1,2]。世界女性健康組織將宮頸癌列為對女性生殖系統(tǒng)威脅最大的惡性腫瘤，晚期轉(zhuǎn)移后預(yù)后較差[3]。所以對于宮頸癌的早期預(yù)防和診斷需要進(jìn)一步提高，研究其發(fā)病機理及病程進(jìn)展過程是解決此問題的關(guān)鍵。

微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源表達(dá)的通常長度為18～23個核苷酸的小型非編碼RNA，可以通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因的非翻譯區(qū)蛋白表達(dá)發(fā)揮作用[4]。目前多項研究顯示miRNA參與各種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、神經(jīng)發(fā)育和干細(xì)胞分化等等，包括腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞，miRNA被認(rèn)為是一種新的基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑[5]。miR-128在多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象[6]。例如，在膠質(zhì)瘤中miR-128明顯下調(diào)[7]。miR-128的過表達(dá)也可以通過靶向E2F3a抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖和運動能力，并減少其轉(zhuǎn)移能力。

腺苷酸轉(zhuǎn)移激酶(Adenylate kinases 2，AK2)是細(xì)胞內(nèi)對細(xì)胞和線粒體能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起重要作用的酶[8]。此外，它們還可用于調(diào)節(jié)AMP介導(dǎo)的反應(yīng)，調(diào)節(jié)單磷酸化和二磷酸化腺嘌呤核苷酸的濃度，影響細(xì)胞增殖行為[9]。在人類細(xì)胞中，AK2也可以參與線粒體凋亡進(jìn)程，抑制細(xì)胞的凋亡[10]。 但是AK2對腫瘤細(xì)胞的真正調(diào)節(jié)功能機制仍不清楚。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-128人宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，作為腫瘤抑制因子通過直接靶向AK2調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。此外，過表達(dá)miR-128可以抑制細(xì)胞增殖和體內(nèi)成瘤能力。本文對miR-128和AK2在宮頸癌中的聯(lián)系做出闡釋。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)和試劑 人宮頸癌細(xì)胞株SiHa、HeLa、Caski和C33a均從上海細(xì)胞研究所購買。細(xì)胞培養(yǎng)條件：在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(FBS)中培養(yǎng)，每500 ml加入100單位青霉素和100 ng鏈霉素。將所有細(xì)胞放在37℃，5%CO2恒溫孵箱中。 STAT3和p-STAT3購買于美國Abcam公司。AK2，GAPDH抗體購買于Sigma公司。

1.1.2慢病毒包裝和穩(wěn)定細(xì)胞系 miR-128-mimic、miR-128-inhibitor和LV5-AK2慢病毒構(gòu)建體購自上海吉瑪基因生物有限公司。慢病毒用Lentiviral包裝包裝系統(tǒng)根據(jù)制造商的說明書(Thermo Fisher Scientific)。 構(gòu)建得到相應(yīng)的穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.2方法

1.2.1qRCR試驗檢測mRNA水平 使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離肺癌細(xì)胞的總RNA，并使用miRNA分離試劑盒進(jìn)一步純化miRNA部分。通過光譜測定RNA樣品的濃度和純度。使用實時PCR系統(tǒng)進(jìn)行實時逆轉(zhuǎn)錄PCR(q-PCR)。U6管家基因作為對照。使用2-ΔΔCt方法計算肺癌細(xì)胞的miRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。PCR引物如下5′-ACACTCCAGCTGGGTCACAGTGGGTC-3′，5′-TGGTGTCGTGGAGTCGTGGTGTCGTG-3′。

1.2.2雙熒光素酶活性測定 為驗證miR-128和AK2的相關(guān)關(guān)系，我們使用雙熒光素酶測定，將24孔板中的miR-128或NC細(xì)胞與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎熒光素酶(Promega)的pRL-TK對照載體共轉(zhuǎn)染，使用 siPORTneoFX試劑盒，根據(jù)使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)(Promega)，轉(zhuǎn)染24 h后測定熒光素酶活性。 對于每個轉(zhuǎn)染的螢火蟲熒光素酶活性被歸一化為海腎熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.3Western免疫印跡 細(xì)胞用胰蛋白酶消化，從培養(yǎng)瓶消化刮下，離心，收集上清液作為總細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物儲存在-80℃。蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE膠分級分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上膜(Whatman，Germany)，并進(jìn)行免疫印跡根據(jù)制造商的說明進(jìn)行分析。使用GAPDH作對蛋白內(nèi)參對照。實驗重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞增殖測定 為了確定miR-128對細(xì)胞增殖的影響，將C33a細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分別用miR-128和NC組慢病毒處理，并培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化并以2 000個細(xì)胞接種每孔96孔板。細(xì)胞的增殖是使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測。根據(jù)說明書每24 h 1次。試驗重復(fù)3次。

1.2.5裸鼠腫瘤實驗 購買雌性裸鼠(4周齡)來自上海實驗動物中心。在無病原體條件飼養(yǎng)。將8只小鼠隨機分為兩組。皮下注射穩(wěn)定表達(dá)miR-128的C33a細(xì)胞進(jìn)入裸鼠兩側(cè)腋下C33a細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)等量注射NC組作陰性對照。測量腫瘤每周3次。 6周后處死裸鼠，并測量腫瘤體積及重量。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌組織和細(xì)胞中MiR-128和AK2的表達(dá)水平 如圖1A所示，AK2在宮頸癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)的水平，免疫組化和蛋白水平都顯示正常宮頸中AK2的表達(dá)高于宮頸癌中。如圖1B顯示，miR-128的表達(dá)水平在不同類型的宮頸癌細(xì)胞株中表達(dá)量不盡相同，C33a的表達(dá)情況最低，選取表達(dá)量較低的C33a細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)miR-128過表達(dá)試驗。

2.2雙熒光素酶驗證miR-128和AK2之間的關(guān)系 我們通過TargetScan搜索生物信息學(xué)檢測AK2是miR-128的直接靶標(biāo)，通過雙熒光素酶試驗驗證AK2和miR-182在宮頸癌細(xì)胞中的相互關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)miR-128具有和AK2相似的的3′-UTR結(jié)合序列(圖2A)。將AK2 3′-UTR克隆到miRNA報告載體中。miR-128的過表達(dá)熒光素酶活性降低到對照組的70%水平(圖2B)，表明miR-128抑制AK2的表達(dá)水平。我們將miR-128-mimic與AK2共轉(zhuǎn)染到宮頸癌C33a細(xì)胞株中。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示(圖2B)：miR-128-mimic可以明顯抑制AK2的熒光素酶活性。表明miR-128能與AK2的3′UTR特異性結(jié)合，并可以調(diào)控AK2的表達(dá)。

圖1 AK2和miR-128在宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of AK2 and miR-128 expression in cervical cancer cell linesNote: A.AK2；B.miR-128.**.P<0.05.(DAB staining,×40).

圖2 驗證miR-128與AK2之間的調(diào)控關(guān)系Fig.2 Verify regulatory relationship between miR-128 and AK2Note: A.Binding site of miR-128 to AK2；B.Double luciferase to detect the relationship between miR-128 and AK2.**.P<0.05.

2.3MiR-128的表達(dá)對C33a細(xì)胞增殖能力的影響 為了研究miR-128對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響，使用C33a細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以增加miR-128的表達(dá)。通過CCK-8實驗檢測miR-128對C33a細(xì)胞增殖情況的影響。如圖3所示，miR-128-mimic組的細(xì)胞的生長速度比其對照組慢得多(P<0.01)，培養(yǎng)96 h后抑制效果顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染了miR-128-inhibitor過后，C33a細(xì)胞的增殖能力相應(yīng)減少，培養(yǎng)96 h后效果顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。綜上所述，miR-128的表達(dá)后可以明顯調(diào)控C33a細(xì)胞的增殖能力。

2.4miR-128抑制細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長 裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，腫瘤生長情況如圖所示(圖4A)：與NC組裸鼠腫瘤大小相比，miR-128-mimic組的腫瘤體積明顯減小[體積(3.05±0.35)cm3vs (0.86±0.11)cm3，P=0.031]，且隨著飼養(yǎng)時間延長，統(tǒng)計學(xué)意義更加明顯。處死裸鼠后，剝除腫瘤重量對比(圖4B)：與NC組相比，miR-128-mimic組裸鼠腫瘤重量明顯減小[(3.26±0.39)g vs (0.89±0.15) g，P=0.016]。表明過表達(dá)miR-128后可以抑制C33a細(xì)胞的體外成瘤能力。

圖3 miR-128對宮頸癌細(xì)胞株增殖能力的影響Fig.3 Effect of miR-128 on proliferation of cervical cancer cell linesNote: **.P<0.05.

圖4 裸鼠成瘤實驗檢測miR-128在宮頸癌細(xì)胞中的作用Fig.4 Role of miR-128 in cervical cancer cells was detected by nude mice tumorigenesisNote: A.Effect of miR-128 on tumorigenesis of cervical cancer cells in nude mice.B,C.nude mice in vivo.**.P<0.05.

2.5miR-128的過表達(dá)對STAT3信號通路激活的影響 免疫印跡法檢測過表達(dá)miR-128后STAT信號通路蛋白的表達(dá)變化情況。在miR-128-mimic實驗組中P-STAT3的表達(dá)情況比NC對照組的明顯降低[(42.12±6.28)% vs (91.25±9.29)%，P<0.05]，而STAT3蛋白的表達(dá)情況在兩組之間差異并沒有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-128后，p-STAT3蛋白表達(dá)水平相應(yīng)下調(diào)，表明STAT3通路活性受到抑制，所以，miR-128可能是通過影響STAT3信號通路的磷酸化水平調(diào)控C33a細(xì)胞的生物學(xué)行為。

2.6過表達(dá)AK2蛋白水平逆轉(zhuǎn)miR-128對p-STAT3的抑制 如上所述，AK2是miR-128下游的直接靶標(biāo)。因此，我們想通過增加AK2的表達(dá)觀察是否以逆轉(zhuǎn)miR-128對下游蛋白通路的抑制情況。LV5-AK2轉(zhuǎn)入miR-128-mimic的宮頸癌細(xì)胞。如圖6A所示，通過轉(zhuǎn)染LV5-AK2后，miR-128的水平相應(yīng)升高。 類似地，如圖6B所示，而miR-128對p-STAT3蛋白的抑制受到相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，表明AK2可以一定程度上逆轉(zhuǎn)miR-128對p-STAT3的抑制，間接證明了miR-128是通過靶向AK2抑制p-STAT3的激活。

圖5 miR-128對STAT3信號通路蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of miR-128 on expression of STAT3 signaling pathway proteinNote: A.Effect of miR-128 on phosphorylated STAT3 pathway.B.The expression level of P-STAT3 protein.**.P<0.05.##.P<0.01.

圖6 AK2對STAT3信號通路蛋白的調(diào)控作用Fig.6 Regulation of STAT3 signaling protein by AK2Note: A.Inhibition of miR-128 expression by AK2;B.AK2 reversibility of STAT3 pathway activation.**.P<0.05.##.P<0.01.

3 討論

宮頸癌是一種常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是由多種因素誘導(dǎo)發(fā)生的[11]。為了在宮頸癌更早期的時候預(yù)測并采取相應(yīng)的預(yù)防處理措施，我們需要更多準(zhǔn)確的方法去診斷宮頸癌。 隨著目前分子診斷學(xué)和生物檢測技術(shù)的進(jìn)步，宮頸癌的分子標(biāo)記物越來越受到關(guān)注，并結(jié)合相關(guān)的臨床分期為宮頸癌治療提供幫助[12]。潛在的分子標(biāo)記在預(yù)測宮頸癌的治療效果方面有重要作用，觀察預(yù)后，鑒別治療風(fēng)險[13]。

最近有很多證據(jù)表明miRNA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[14]。鑒定腫瘤相關(guān)的miRNAs和他們的直接靶基因?qū)τ谀[瘤的發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有重要作用[15,16]。我們通過生物信息學(xué)方法分析，預(yù)測到miR-128在宮頸癌中表達(dá)異常，且可以調(diào)節(jié)在細(xì)胞增殖中起重要作用的相關(guān)基因，對細(xì)胞的分裂、新陳代謝、運動和凋亡行為都具有一定的影響。因此在驗證過程中，我們發(fā)現(xiàn)miR-128顯著促進(jìn)宮頸細(xì)胞的增殖能力，然后探討其下游相關(guān)靶向作用因子。

AK的高表達(dá)狀態(tài)可以促進(jìn)線粒體ATP的生成，釋放相應(yīng)能量，促進(jìn)細(xì)胞運動能力[17]，表明過表達(dá)AK2可以為細(xì)胞增殖提供足夠的能量。有研究表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中增加AK2的表達(dá)可以明顯促進(jìn)U251細(xì)胞的增殖和遷移速率[18]。 Heldt等[19]的研究也表明，細(xì)胞體內(nèi)的AK2的增多可以通過加速循環(huán)細(xì)胞有絲分裂速度達(dá)到迅速擴增的效果。

越來越多的學(xué)者對腫瘤自我更新能力的研究感興趣。有研究表示，miR-128可以作為細(xì)胞自我更新行為中的一種調(diào)節(jié)劑[20]，這不僅適用于與正常細(xì)胞有關(guān)的研究，腫瘤生物的細(xì)胞更新也可受此影響。此外，有學(xué)者證實，過表達(dá)miR-128可以對腫瘤細(xì)胞的生長和擴散起到明顯的抑制作用[21]。miR-128可以與下游的多個靶標(biāo)產(chǎn)生作用。例如，表皮生長因子受體是miR-128的相關(guān)靶標(biāo)，在肺癌中表現(xiàn)出相應(yīng)抑制作用[22]。然而，在宮頸癌中，miR-128和下游靶標(biāo)的相關(guān)關(guān)系尚無文獻(xiàn)報道，針對miR-128對宮頸癌的診斷和治療意義也是無證據(jù)可追溯，所以我們力圖去完善此方向的研究。

STAT3是屬于JAK/STAT家族的一類轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，當(dāng) STAT3發(fā)生磷酸化的時候形成二聚體，并轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)與染色體上啟動子相結(jié)合，誘導(dǎo)位于其下游的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活，從而發(fā)揮相應(yīng)作用[23]。STAT3和 P-STAT3在多種人類惡性腫瘤組織如肺癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌中均有明顯表達(dá)，且持續(xù)高水平的 STAT3磷酸化的激活可誘導(dǎo)其下游腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到拮抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成及新陳代謝以及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)生的作用[24,25]。

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控子可以調(diào)控多種細(xì)胞的生理和病理活動[26]。miRNA的異常表達(dá)通常被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。最近很多研究表明，與正常組織相比，miR-128在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[27]。我們的研究表明miR-128在宮頸癌中的表達(dá)下調(diào)，結(jié)果表明miR-128可能參與宮頸癌的發(fā)病起因。為探討具體的作用方式及是否與下游相關(guān)蛋白相互作用，我們使用生物信息學(xué)預(yù)測miR-128下游的潛在靶標(biāo)。我們確認(rèn)AK2是miR-128的作用靶標(biāo)，而且通過過表達(dá)AK2可以抑制miR-128的相關(guān)作用。AK2的過表達(dá)也可以間接調(diào)控STAT3磷酸化的激活，繼而影響STAT3信號通路，干擾宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為。因此，這項研究不僅有助于揭示miR-128在調(diào)節(jié)宮頸癌生長中的新機制，而且通過定位AK2，也可以對宮頸癌的靶向診斷和治療提供支持。

綜上所述，本研究表明miR-128在宮頸癌細(xì)胞株C33a的侵襲遷移中起重要作用，并對其相關(guān)機制做進(jìn)一步探討，這些結(jié)果為我們提供了miR-128在宮頸癌病理學(xué)的作用和機制中新的見解，為宮頸癌治療提供了潛在的治療策略。

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EffectofmiR-128andAK2onbiologicalbehaviorofcervicalcancercellsbySTAT3signalingpathway

YANGLin-Qing，SUNYing-Chuan.

TheUniversityofXuchang,Xuchang461000,China

Objective:To investigate the mechanism of miR-128 on the expression of AK2 protein through the STAT3 signaling pathway on the biological behavior of cervical cancer cells.MethodsThe expression of AK2 and miR-128 in cervical cancer tissues and cells was detected by qPCR and Western blot.Double luciferase assay was used to detect the interaction between miR-128 and AK2.CCK-8 proliferation assay was used to detect the effect of miR-128 on the enhancement of cervical cancer cells.The effect of miR-128 on the tumorigenesis of cervical cancer cells was exa mined by tumor formation test in nude mice.Western blot was used to detect the effect of miR-128 on STAT3 signal pathway protein level.Western blot was used to detect the inhibitory effect of miR-128 on p-STAT3 by overexpressing AK2 protein.ResultsThe expression level of AK2 in cervical cancer tissues was higher than that in normal cervical tissues,and the expression level of miR-128 in cervical cancer C33a cells was lower.Double luciferase assay confirmed that miR-128 could directly target the expression of AK2.CCK-8 proliferation test showed that miR-128 could inhibit the proliferation of cervical cancer cell lines.In vivo tumorigenesis test showed that the increase of miR-128 could inhibit the tumorigenesis ability of cervical cancer cells[volume(3.05±0.35)cm3vs (0.86±0.11)cm3，P=0.031；weight(3.26±0.39)g vs (0.89±0.15)g，P=0.016];Western blot showed that miR-128 could inhibit the activation of p-STAT[(42.12±6.28)% vs (91.25±9.29)%，P<0.05],while the overexpression of AK2 could reverse the inhibitory effect of miR-128 on p-STAT.ConclusionmiR-128 is used to regulate the expression of AK2 and regulate the biological behavior of cervical cancer cells through the activation of STAT3 pathway.

miR-128;Cervical cancer;AK2;CCK-8

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.006

R737.33

A

1000-484X(2017)12-1783-06

①本文為河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目(201203068)。

楊林青(1983年-)，女，實驗師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)方面的研究，E-mail：yllys_89@163.com。

[收稿2017-05-15 修回2017-06-19]

(編輯 許四平 劉格格)