龐 盼 張峰波 朱玥潔 賈 斌 張躍新 張春桃 甫拉提·熱西提 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

布魯氏菌病患者中PD-1和PD-L1的表達(dá)①

龐 盼 張峰波②朱玥潔③賈 斌④張躍新④張春桃 甫拉提·熱西提 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

目的研究程序性死亡受體1(PD-1)/與配體(PD-L1)以及相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)和白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)在布魯氏菌病(Brucellosis)患者中的變化。方法選取60例布魯氏菌病患者與60例健康志愿者，采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)其外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)，以及樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)中PD-L1的表達(dá)，同時(shí)采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)(Cytometric bead array，CBA )檢測(cè)血清中TGF-β和IL-10的變化，采用Pearson法分析布魯氏菌病患者體內(nèi)PD-1與TGF-β及IL-10的相關(guān)性，并對(duì)34例布魯氏菌病治愈患者進(jìn)行了追蹤隨訪。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，布魯氏菌病患者組外周血中PD-1、PD-L1的表達(dá)及血清中TGF-β和IL-10的水平均明顯升高(P<0.01),而治愈組外周血中PD-1、PD-L1的表達(dá)及血清中TGF-β和IL-10的水平較治療前明顯降低(P<0.01),并且布魯氏菌病患者組PD-1的表達(dá)與TGF-β (r=0.817,P<0.01)及IL-10均呈正相關(guān)(r=0.835,P<0.01)。結(jié)論P(yáng)D-1/PD-L1及TGF-β和IL-10在布魯氏菌病患者體內(nèi)高表達(dá)，可能共同參與了布魯氏菌對(duì)宿主免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控作用。

PD-1；PD-L1；布魯氏菌?。患?xì)胞因子

布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱“布病”，是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的人畜共患病，在我國(guó)牧區(qū)流行較為嚴(yán)重，新疆是該病的高發(fā)地區(qū)之一，目前研究發(fā)現(xiàn)布病的發(fā)生與宿主免疫功能下降有關(guān)[1-4]。 我們前期檢測(cè)布病患者血清中可溶性負(fù)性協(xié)同刺激分子Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，Tim-3)和可溶性程序性死亡蛋白1(Programmed death-1，PD-1)，發(fā)現(xiàn)布病患者血清中sTim-3和sPD-1升高，并存在Th1/Th2細(xì)胞的失衡[5,6]。負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-1以膜型和可溶型兩種形式存在，屬于CD28/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)免疫球蛋白超家族，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，在抗感染免疫中可下調(diào)或抑制T細(xì)胞的活化和某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫抑制功能，從而使宿主對(duì)病原體的清除能力減弱[7-9]。程序性死亡分子配體(Programmed death ligands，PD-L1，B7-H1) 主要表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)表面[10,11]。許多研究證實(shí)膜型PD-1和PD-L1在結(jié)核病、肝炎以及艾滋病等感染性疾病中發(fā)揮重要的免疫抑制作用[12-14],但其在布病中的作用機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)布病患者組、治愈組以及健康對(duì)照組外周血中T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，DC細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，同時(shí)采用CBA檢測(cè)TGF-β及IL-10的變化，分析負(fù)性免疫分子PD-1/PD-L1和TGF-β及IL-10在布病感染治療前后的變化特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1資料 收集2016年1月～2017年4月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科就診的60例門(mén)診患者，年齡5～80歲，中位年齡為45歲，其中男性患者49例，女性患者11例。收集34例布病患者治愈組，年齡6～78歲，中位年齡43歲，其中男性患者26例，女性患者8例。布病病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：布病的診斷參照2012年我國(guó)頒布的《布魯氏菌病診療指南(試行)》標(biāo)準(zhǔn)[15]：有流行病學(xué)史，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、骨關(guān)節(jié)痛、睪丸痛、全身乏力等癥狀，血清學(xué)檢查中虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性，試管凝集試驗(yàn)(SAT)滴度為1∶100及以上或菌培養(yǎng)陽(yáng)性，排除傷寒、副傷寒、風(fēng)濕熱及結(jié)核、敗血癥等疾病。同時(shí)選取60例同期體檢的健康人群作為正常對(duì)照組，年齡性別均與病例組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有對(duì)照及患者均簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(20150225-94)。

1.2方法

1.2.1樣本處理 將收集到的60例布病患者組、34例治愈組以及60例對(duì)照組的全血標(biāo)本均經(jīng)2 000 r/min離心10 min,吸取上清于EP管中；將剩下的血細(xì)胞吸取至15 ml離心管中，加入與血細(xì)胞等體積的PBS用巴氏管輕輕吹打混勻，再取與血細(xì)胞等體積的淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶|P8610|人外周血淋巴細(xì)胞分離液)注入50 ml離心管中，將與PBS充分混勻的血細(xì)胞用巴氏管沿管壁緩慢注入50 ml離心管中，2 000 r/min離心20 min，提取單核細(xì)胞。

1.2.2TGF-β和IL-10的檢測(cè) 采用CBA技術(shù)檢測(cè)60例布病患者組、34例治愈組和60例正常對(duì)照組血清中TGF-β和IL-10(Cytometric Bead Array Human TGF-β、IL-10 Cytokine Kit，BD公司)的水平，標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋濃度依次為 5 000、2 500、1 250、625、312.5、156、80、40、20、0 pg/ml，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀分析讀取數(shù)據(jù)(流式細(xì)胞儀為德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TGF-β和IL-10的水平。

1.2.3PD-1和PD-L1的檢測(cè) 用提取的單核細(xì)胞分別檢測(cè)布魯氏菌患者組、治愈組、對(duì)照組T細(xì)胞表面的PD-1和DC細(xì)胞表面的PD-L1。在T細(xì)胞流式管中分別加入APC標(biāo)記的CD3、Percp 標(biāo)記的CD4、FITC 標(biāo)記的CD8、PE 標(biāo)記的PD-1單克隆抗體，分別為1 μl、2 μl、2 μl、2 μl；在DC細(xì)胞流式管中分別加入Percp 標(biāo)記的CD11c、PE 標(biāo)記的PD-L1、PE-cy7 標(biāo)記的HLA-DR 單克隆抗體各2 μl(所有流式單克隆抗體均購(gòu)自BD公司，流式細(xì)胞儀為德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，室溫避光15 min 后，用PBS 洗滌2 次，PBS 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106ml-1。上機(jī)檢測(cè)至少10 000 個(gè)細(xì)胞，采用FSC/SSC 雙參數(shù)設(shè)門(mén)，分析PD-1;采用FSC/SSC 雙參數(shù)設(shè)門(mén)，再用HLA-DR/CD11c設(shè)門(mén)，選定HLA-DR+CD11c+細(xì)胞即為DC，進(jìn)一步分析DC表面PD-L1 表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1布病患者基本資料情況 收集的60例布病患者均有流行病學(xué)史、經(jīng)虎紅實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性確診為布病的患者。基本情況如表1、2所示。

2.2布病患者組、治愈組和正常對(duì)照組PD-1和PD-L1的表達(dá) 本研究用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞表面PD-1，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，布病組PD-1在CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)均明顯增高(P<0.01)，而治愈組PD-1在CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)較治療前明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表3，圖1、2。

2.3布病患者組、治愈組和正常對(duì)照組血清中TGF-β和IL-10的水平 本研究用CBA法檢測(cè)出布病患者組、治愈組和正常對(duì)照組血清中TGF-β的水平分別為(912.77±91.05)pg/ml、(418.19±63.40)pg/ml、(406.59±67.35)pg/ml，與正常對(duì)照組相比，布病患者組TGF-β的水平明顯增高(P<0.01)，而治愈組TGF-β的水平較治療前明顯降低(P<0.01)；用CBA法檢測(cè)出布病患者組、治愈組和正常對(duì)照組血清中IL-10的水平分別為(27.18±5.88)pg/ml、(5.48±1.79)pg/ml、(5.10±1.31)pg/ml，與正常對(duì)照組相比，布病患者組IL-10的水平明顯增高(P<0.01)，而治愈組IL-10的水平較治療前明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.4布病患者PD-1的表達(dá)與TGF-β 和IL-10的相

表1布病患者的臨床特征

Tab.1ClinicalcharacteristicsofpatientswithBrucella

CharacteristicsCategoriesNumber(percentage,%)ofpatients(n=60)ThehistoryofepidemiologyBreedingandcontacthistoryofcattleandsheep57(95%)Eatingundercookedmeatanddairyproducts3(5%)Fever37-37.9℃2(3%)38-38.9℃24(40%)≥39℃34(57%)WeakYes60(100%)HyperhidrosisYes58(97%)No2(3%)ArthrodyniaYes56(93%)No4(7%)GenderMalepatients49(82%)Femalepatients11(18%)Age(years)≥45years34(57%)<45years26(43%)AST1∶1006(10%)1∶20012(20%)1∶40042(70%)

關(guān)性 本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出PD-1在布病患者外周血單核細(xì)胞上表達(dá)增高，利用CBA法檢測(cè)出TGF-β 和IL-10在布病患者血清中水平增高。通過(guò)Pearson 法分析布病患者體內(nèi)PD-1與TGF-β 和IL-10的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)布病患者體內(nèi)PD-1的表達(dá)與TGF-β(r=0.817，P<0.01)和IL-10(r=0.835，P<0.01)的水平均呈明顯的正相關(guān)，見(jiàn)圖4。

圖1 布病患者組、治愈組和對(duì)照組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)Fig.1 Expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells in brucellosis patients group(A),cured group(B) and control group(C)Note: A.The expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells of brucellosis patients group;B.The expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells of cured group;C.The expression of PD-1 on CD3+T cells,CD4+T cells and CD8+T cells of control group.

表2布病患者組、治愈組和正常對(duì)照組急性炎癥因子

Tab.2Brucellosispatientsgroup，curedgroupandnormalcontrolgroupofacuteinflammation

GroupsNumber(n)Procalcitonin(ng/ml)IL-6(pg/ml)Hs-CRP(mg/ml)WBC(×109L-1)Neutrophils(%)Brucellosis607.94±1.211)59.11±2.691)31.4±2.681)11.9±1.281)0.83±0.021)Cured340.99±0.012)2.76±0.672)1.06±0.022)5.23±1.352)0.43±0.012)Control600.28±0.122.28±0.430.57±0.014.01±0.850.46±0.02

Note：Compared with control group,brucellosis patients group had the higher acute inflammation expression，1)P<0.01；while in the patients receiving follow-up cured,the acute inflammation expression were remarkably lower than those in pretherapy，2)P<0.01.

表3布病患者組、治愈組和正常對(duì)照組PD-1和PD-L1的表達(dá)

Tab.3ExpressionofPD-1/PD-L1inbrucellosispatientsgroup,curegroupandcontrolgroup

GroupsNumber(n)PD-1(%)CD3+TcellCD4+TcellCD8+TcellPD-L1(%)DCcellBrucellosis6048.71±6.431)42.72±5.061)77.30±5.891)60.10±7.431)Cured349.97±1.022)4.12±1.032)10.10±1.042)9.83±1.262)Control606.74±1.476.67±1.038.83±1.578.18±1.04

Note：Compared with control group,brucellosis patients group had the higher PD-1/PD-L1 expression，1)P<0.01；while in the patients receiving follow-up cured,the PD-1/PD-L1 expression were remarkably lower than those in pretherapy，2)P<0.01.

圖2 布病患者組、治愈組和對(duì)照組PD-L1的表達(dá)Fig.2 Expression of PD-L1 in brucellosis patients group,cured group and control group

圖3 各組血清中TGF-β和IL-10的水平Fig.3 Comparison of serum TGF-β and IL-10 in 3 groupsNote: *.P<0.01，brucellosis group and control group； #.P<0.01,brucellosis group and cured group.

3 討論

PD-1/PD-L1在宿主體內(nèi)發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用，主要通過(guò)向T細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制信號(hào)，阻礙效應(yīng)T細(xì)胞活化和增殖，參與自身免疫病、腫瘤和感染性疾病的發(fā)生發(fā)展[16-18]。通常PD-1主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，而PD-L1分布較為廣泛，在T細(xì)胞、B細(xì)胞以及抗原提呈細(xì)胞等表面均有表達(dá)，DC細(xì)胞屬于專職抗原提呈細(xì)胞，能夠激活初始和記憶性CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、調(diào)控及維穩(wěn)中發(fā)揮重要作用[19]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)布病患者T細(xì)胞表面PD-1和DC細(xì)胞表面PD-L1，發(fā)現(xiàn)布病患者組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與DC細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，而治愈組PD-1與PD-L1的表達(dá)較治療前明顯降低，推測(cè)在布病患者體內(nèi)PD-1發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)控作用，抑制T細(xì)胞的免疫功能，使布魯氏菌發(fā)生免疫逃逸；當(dāng)布病患者體內(nèi)T細(xì)胞表面PD-1高達(dá)到一定程度時(shí)，與DC細(xì)胞表面的PD-L1結(jié)合，PD-1/PD-L1通路形成，抑制DC細(xì)胞的抗原提呈作用，進(jìn)而使T細(xì)胞的功能減弱，分泌的相關(guān)細(xì)胞因子減少，不利于布魯氏菌的清除。

圖4 PD-1與TGF-β和IL-10的相關(guān)性Fig.4 Correlation analysis of PD-1 with TGF-β and IL-10

TGF-β和IL-10是具有免疫抑制作用的主要細(xì)胞因子，大多由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cell，Treg)分泌，Treg細(xì)胞可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(aTreg 或 iTreg)，如Th3、Tr1，其中Tr1細(xì)胞分泌IL-10，Th3細(xì)胞分泌TGF-β[20]。研究表明，Treg細(xì)胞在布魯氏菌感染中可通過(guò)分泌細(xì)胞因子TGF-β和IL-10抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[21-23]。本研究通過(guò)檢測(cè)布病患者組、治愈組和對(duì)照組血清中TGF-β和IL-10的水平發(fā)現(xiàn)，布病組TGF-β和IL-10的水平明顯高于正常對(duì)照組，而治愈組TGF-β和IL-10的水平較治療前明顯降低，推測(cè)在布魯氏菌感染過(guò)程中Treg細(xì)胞增多，分泌的相應(yīng)細(xì)胞因子功能增強(qiáng)。關(guān)于PD-1/PD-L1的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TGF-β可通過(guò)激活Smad3信號(hào)上調(diào)PD-1，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的功能[24]。Diana等[25]在研究腫瘤疫苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-10增加可抑制抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell,APC)的功能，抑制T細(xì)胞活化，同時(shí)可作用于DC細(xì)胞上調(diào)PD-L1。本研究通過(guò)分析布病患者體內(nèi)PD-1與TGF-β和IL-10的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)布病患者體內(nèi)PD-1的表達(dá)與TGF-β和IL-10的水平均呈明顯的正相關(guān)，推測(cè)在布魯氏菌感染中Treg可能增高，其分泌的相關(guān)性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10也隨之增多，TGF-β可能通過(guò)激活Smad3信號(hào)上調(diào)PD-1，IL-10可能通過(guò)作用于DC細(xì)胞上調(diào)PD-L1，有利于PD-1/PD-L1信號(hào)通路的形成，傳遞大量的負(fù)性刺激信號(hào)，在布魯氏菌感染中起著重要的負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述，在布魯氏菌感染中，TGF-β和IL-10表達(dá)增高使PD-1/PD-L1通路被激活，負(fù)調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，抑制T細(xì)胞的殺菌功能，使布魯氏菌不能被有效清除，導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)感染。若能研制出下調(diào)TGF-β、IL-10、 PD-1和PD-L1的靶向藥物，布病將可能會(huì)得到很好的控制。

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ExpressionofPD-1andPD-L1inpatientsinfectedwithBrucella

PANGPan,ZHANGFeng-Bo,ZHUYue-Jie,JIABin,ZHANGYue-Xin,ZHANGChun-Tao.REXITI·Fulati,DINGJian-Bing.

CollegeofPreclinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

Objective:To investigate the roles of PD-1 and PD-L1,as well as related cytokines TGF-β and IL-10 in patients infected with Brucella.MethodsThe expression of PD-1/PD-L1 in peripheral blood mononuclear cell CD3+T cells,CD4+T cells,CD8+T cells,and dendrites cells was detected by flow cytometry in 60 patients infected with Brucella and 34 patients receiving follow-up cured and 60 healthy controls,the serum levels of TGF-β and IL-10 were detected by CBA.The correlations of PD-1 with TGF-β and IL-10 levels in patients infected with Brucella were analyzed by pearson correlation test.ResultsCompared with control,brucellosis patients had the higher PD-1/PD-L1,TGF-β and IL-10 expression (P<0.05),while in the patients receiving follow-up cured,the PD-1/PD-L1,TGF-β and IL-10 were remarkably lower than those in pretherapy (P<0.01),the change of PD-1 was positively correlated with the levels of TGF-β (r=0.817,P<0.01) and IL-10 (r=0.835,P<0.01).ConclusionHigh expression of PD-1/PD-L1 and TGF-β and IL-10 in patients with Brucella may be involved in the negative regulation of Brucella on host immune response.

PD-1;PD-L1;Brucellosis;Cytokine

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.017

R392.11R378.5

A

1000-484X(2017)12-1838-05

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560322)、新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015211C100)和新疆醫(yī)科大學(xué)科學(xué)創(chuàng)新基金(XYDCX201507)。

②新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,烏魯木齊 830011。

③新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖助孕科,烏魯木齊 830011。

④新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，烏魯木齊 830011。

龐 盼(1990年-),女,在讀碩士,主要從事布魯氏菌感染方面的研究,E-mail: 2449579487@qq.com。

及指導(dǎo)教師：丁劍冰(1960 年-),女,博士,教授,免疫教研室主任,博士生導(dǎo)師,主要從事感染免疫和生殖免疫方面的研究, E-mail: djbing002@sina.com。

[收稿2017-06-21 修回2017-08-08]

(編輯 倪 鵬)