吳 瓊，戚琴芹，耿 軍，沈錢(qián)能，余佳倩，陸洪良，黨 偉*

(1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036; 2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018)

不同孵化溫度對(duì)中華鱉新生幼體免疫能力的影響

吳 瓊1*，戚琴芹1，2*，耿 軍1，沈錢(qián)能1，余佳倩1，陸洪良1，黨 偉1**

(1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036; 2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018)

本研究選取中華鱉作為研究對(duì)象，在恒定溫度28 ℃和波動(dòng)溫度(28±2) ℃條件下孵化中華鱉卵，對(duì)新生幼體的免疫能力和免疫指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果表明，波動(dòng)溫度孵化條件下的新生中華鱉幼體對(duì)細(xì)菌的抵抗能力更強(qiáng)；但通過(guò)注射植物血球凝集素來(lái)刺激幼體的免疫反應(yīng)，兩組之間的差異并不顯著.

孵化溫度；中華鱉；新生幼體；免疫能力；植物凝集素

爬行動(dòng)物作為變溫動(dòng)物，其體溫的維持依賴(lài)于外界溫度，因此其生命活動(dòng)很大程度上受到外界溫度的影響[1-2].對(duì)于卵生爬行動(dòng)物來(lái)說(shuō)，孵化的過(guò)程是爬行動(dòng)物生命的初始階段，孵化溫度會(huì)影響爬行動(dòng)物行為體型、生長(zhǎng)速率、生活環(huán)境的選擇以及行為能力[3].爬行動(dòng)物的性別也不同于哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)保守的基因決定，而受孵化溫度或環(huán)境溫度的影響比較大，爬行動(dòng)物的性別決定處于溫度決定型和基因決定型的過(guò)渡期[4].關(guān)于爬行動(dòng)物孵化溫度對(duì)免疫能力的影響報(bào)道較少.

中華鱉是國(guó)內(nèi)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，同時(shí)也是爬行動(dòng)物的代表物種之一，中華鱉恒溫孵化溫度區(qū)間為24—34 ℃，28—30 ℃是較為合適的孵化溫度[5].已有研究表明孵化溫度對(duì)中華鱉性別沒(méi)有影響[6].已有的關(guān)于中華鱉波動(dòng)溫度孵化，多集中在幼體形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力方面的研究[7]，本研究中設(shè)置一個(gè)恒溫孵化溫度28 ℃，一個(gè)波動(dòng)孵化溫度(28±2) ℃，排除溫度對(duì)性別影響的因素，研究重點(diǎn)側(cè)重于溫度孵化對(duì)中華鱉幼體免疫能力的影響.

使用致病菌攻毒和植物血球凝集素刺激兩種方式對(duì)新生幼體免疫能力進(jìn)行檢測(cè).植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)是一種從菜豆(Phaseolusvulgaris)中分離獲得的促細(xì)胞分裂素，是植物凝集素的一種.植物凝集素可以誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)多種細(xì)胞類(lèi)型包括T細(xì)胞在內(nèi)的炎癥反應(yīng)，因此在脊椎動(dòng)物中，使用植物凝集素皮下注射，根據(jù)皮膚的腫脹程度來(lái)反映免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，腫脹程度越高表明免疫反應(yīng)越強(qiáng)烈[8-10].

1 材料與方法

1.1 中華鱉卵的孵化和新生幼體體重的測(cè)定

2015年5月從杭州市余杭區(qū)上升農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司購(gòu)得中華鱉受精卵480枚，分為兩組，每組240只，稱(chēng)重后置于鋪有潮濕的蛭石的孵化盒中，每盒40只，分別放置在溫度設(shè)置為28 ℃和(28±2) ℃ (24 h內(nèi)，最高孵化溫度為26 ℃，最低孵化溫度為30 ℃，溫度曲線(xiàn)呈正弦曲線(xiàn)狀)的孵化箱中進(jìn)行孵化，每3日補(bǔ)充基質(zhì)散失的水分以保持基質(zhì)濕度恒定.在孵化后期，每天檢查孵化箱情況，將孵出幼體單個(gè)分開(kāi)培養(yǎng)在28 ℃的溫室中，待幼體剩余卵黃完全吸收后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作.

1.2 新生中華鱉幼體免疫能力的檢測(cè)

使用本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的中華鱉致病菌嗜水氣單胞菌對(duì)兩個(gè)不同溫度處理的新生幼體進(jìn)行攻毒檢測(cè)，計(jì)算獲得該致病菌的半致死劑量(LD50).注射細(xì)菌濃度梯度為5 × 103CFU， 5 × 104CFU， 5 × 105CFU和5 × 106CFU，每組注射20只.

1.3 新生中華鱉幼體對(duì)植物血球凝集素的免疫反應(yīng)

選取7只和10只新生中華鱉于28 ℃和(28±2) ℃溫度孵化，然后分別用植物血球凝集素注射. 濃度為2.5 mg/ml的植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)20 μl分別注射新生幼體前肢的蹼和后肢的肌肉.其中左側(cè)肢為對(duì)照側(cè)，注射20 μl磷酸緩沖液(PBS)；右側(cè)肢為實(shí)驗(yàn)側(cè)，注射PHA.使用游標(biāo)卡尺(Mitutuyo, 準(zhǔn)確度: 0.01 mm)測(cè)量時(shí)間分別為注射前，注射后1h、3h和5h.使用公式(免疫強(qiáng)度=(肢體注射PHA后厚度-肢體注射PHA前厚度)-(肢體注射PBS后厚度-肢體注射PBS前厚度))計(jì)算反映新生幼體的免疫強(qiáng)度，前后肢分別計(jì)算.

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0分析致病菌的半致死劑量(LD50).使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Statistica 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析前，分別檢驗(yàn)其正態(tài)性(Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn))和方差同質(zhì)性(Bartlett檢驗(yàn)).使用多因子方差分析檢測(cè)孵化溫度對(duì)中華鱉幼體體重的影響.使用單因子方差分析檢測(cè)植物凝集素注射對(duì)肌肉腫脹度的影響，Tukey多重比較檢驗(yàn)多樣本處理間的差異.描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平設(shè)置為α= 0.05.

2 結(jié)果

28 ℃和(28±2) ℃入孵的中華鱉卵平均重量分別為(3.98 ± 0.03) g和(4.06 ± 0.04) g，新生幼體的初生體重分別為(2.79 ± 0.03 )g和(2.92 ± 0.03) g，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示28 ℃孵化的新生中華鱉幼體體重顯著低于(28±2 )℃孵化的新生中華鱉幼體體重(ANCOVA; F1, 353= 11.13,Plt; 0.001).

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0中的Probit模塊，根據(jù)不同濃度梯度細(xì)菌注射后中華鱉初生幼體累積死亡個(gè)體數(shù)計(jì)算獲得不同溫度孵化組28 ℃和(28±2) ℃的致病菌LD50分別是1.15 × 105CFU和 3.25 × 105CFU.

分析注射植物凝集素后免疫強(qiáng)度數(shù)據(jù)顯示，溫度孵化組28 ℃和28±2℃不同時(shí)間點(diǎn)前肢免疫強(qiáng)度無(wú)顯著差異(F2, 18= 0.38791,P= 0.68401；F2, 27= 0.59758,P= 0.55726)，后肢也沒(méi)有顯著差異(F2, 18= 0.31764,P= 0.73186).注射后不同時(shí)間點(diǎn)不同溫度孵化組之間前后肢免疫強(qiáng)度也無(wú)顯著差異(如圖1和圖2所示).

圖1 中華鱉幼體注射植物血球凝集素后前肢腫脹程度Fig. 1 The swelling height of Chinese soft-shelled turtle foreleg after PHA injection

圖2 中華鱉幼體注射植物血球凝集素后后肢腫脹程度Fig. 2 The swelling height of Chinese soft-shelled turtle hindlimb after PHA injection

3 討論

從獲得的半致死量的數(shù)據(jù)來(lái)看，(28 ± 2) ℃孵化溫度條件下孵出的幼體抵抗病菌的能力強(qiáng)于28 ℃恒溫孵化的幼體，從而說(shuō)明其免疫能力較強(qiáng).本課題組以前的研究結(jié)果表明，低于28 ℃恒溫孵化的幼體抗菌能力高，而高于28 ℃恒溫孵化的幼體抗菌能力弱[11]，本研究中設(shè)置的波動(dòng)孵化溫度(28±2) ℃并未因?yàn)樽罡叻趸瘻囟雀哂?8 ℃而出現(xiàn)抗菌能力變?nèi)醯默F(xiàn)象.波動(dòng)孵化溫度影響新生幼體免疫能力的通路可能不同于恒溫孵化溫度.

注射植物凝集素在爬行動(dòng)物中較多應(yīng)用，在蜥蜴中通過(guò)測(cè)量計(jì)算注射植物凝集素后12 h肌肉的腫脹程度來(lái)反映其免疫能力的強(qiáng)弱[9-10].然而，在中華鱉中，本課題組在其他的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)注射12 h后肌肉腫脹完全消失.因此，在本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置更早時(shí)間點(diǎn)對(duì)肌肉腫脹程度的測(cè)定，結(jié)果分析表明，無(wú)論是組間還是組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)，植物凝集素對(duì)中華鱉肌肉的腫脹度并沒(méi)有顯著差異.說(shuō)明注射植物凝集素的結(jié)果作為一項(xiàng)免疫指標(biāo)并不適合中華鱉來(lái)反映其免疫能力的強(qiáng)弱.

目前對(duì)于爬行動(dòng)物的研究多集中在生態(tài)學(xué)和行為學(xué)的研究，本研究的目的在于借鑒其他物種研究手段更全面的理解爬行動(dòng)物在適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中環(huán)境溫度對(duì)免疫能力的影響.動(dòng)物體對(duì)細(xì)菌的抵抗力是一個(gè)綜合的免疫反應(yīng)過(guò)程，本課題組在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)更深入進(jìn)行反應(yīng)通路的研究.中華鱉作為爬行動(dòng)物的代表物種之一，有其特殊的優(yōu)勢(shì)，研究對(duì)象較其他野生爬行動(dòng)物而言更易獲得，對(duì)其進(jìn)行深入的研究，成熟的結(jié)果可以直接應(yīng)用于其它爬行動(dòng)物，也能夠在研究過(guò)程中，減少對(duì)野生爬行動(dòng)物的影響.

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TheEffectsofDifferentIncubationTemperaturesontheImmunocompetenceofChineseSoft-shelledturtle(Pelodiscussinensis)'Hatchlings

WU Qiong1, QI Qinqin1,2, GENG Jun1, SHEN Qianneng1, YU Jiaqian1, LU Hongliang1, DANG Wei1

(1.College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

In this study, the eggs of Chinese soft-shelled turtle were incubated in two different temperatures, the constant temperature 28 ℃and the fluctuation temperature (28±2) ℃. The immunocompetences of the hacthlings from these two incubation temperature were examed. The results showed that hatchlings from the fluctuation temperature were more resistant to pathogen challenges. But the immune responses after phytohemagglutinin showed no significant difference between the two groups.

incubation temperature; Chinese soft-shelled turtle; newborn larvae; immunocompetence; phytohemagglutinin

2017-03-23

* 兩位作者對(duì)本論文貢獻(xiàn)一致

浙江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(LY15C030006)；杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專(zhuān)項(xiàng)(20150432B04)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目.

黨偉(1984—)，女，助理研究員，博士，主要從事爬行動(dòng)物生態(tài)學(xué)研究. E-mail：dang.wei@hotmail.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.05.011

Q948

A

1674-232X(2017)05-0514-04