石雪萍

(江蘇經貿職業(yè)技術學院 工程技術學院，南京 210007)

花椒中生物堿測定方法及提取工藝研究

石雪萍

(江蘇經貿職業(yè)技術學院 工程技術學院，南京 210007)

采用乙醇水浴浸提法提取生物堿，電位滴定法測定生物堿含量。通過單因素試驗確定了從花椒中提取生物堿的工藝參數(shù)的適宜范圍，并進一步通過正交試驗確定最佳提取工藝。結果表明：采用電位滴定法能夠準確找到滴定終點，再根據(jù)酸堿反應可計算出生物堿含量。采用乙醇熱浸提法通過單因素試驗和正交試驗研究了某品種花椒中總生物堿的提取工藝，乙醇熱浸提最適宜的提取工藝條件為：采用體積分數(shù)為80%乙醇為提取劑，料液比為1∶10，浸提溫度為70 ℃，浸提3 h，乙醇熱浸提法提取生物堿的最佳提取率為2.11%。

花椒；生物堿；測定；提取工藝

花椒(學名：ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，蕓香科植物青椒或花椒的干燥成熟果實?；ń愤€是一味傳統(tǒng)的中藥，具有很多藥用價值。可以溫暖身體，去除寒氣和濕氣，保護胃和脾?？墒柰c胃，促進排尿、便，有利防治便秘；對女性生理期的疼痛也具有相當好的緩解作用；同時對驅蟲殺蟲、治療高血壓、糖尿病和心臟病都有一定的保護作用[1]。

花椒中的功能性成分主要包括花色苷(黃酮類)、生物堿、木質素、脂肪酸等。花椒本屬類植物普遍都含有生物堿類[2]。國內外很多學者、研究者對花色苷及生物堿的結構、性質、功效進行了研究[3-5]。

生物堿是一類含氮的堿性有機化合物，有類似于堿的性質。大多數(shù)都有氮雜環(huán)結構，氮素多包含在環(huán)內，皆有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一，還具有光學活性[6]。生物堿的檢測方法主要有酸性染料比色法[7]、電位滴定法[8]、紫外吸收法[9]等。提取方法主要有水提取法、氨-氯仿法、有機溶劑提取法、超聲波提取法[10，11]等。

花椒中的生物堿是花椒呈現(xiàn)麻味的主要成分物質，目前諸多學者對花椒生物堿的提取測定產生了濃厚的興趣。本實驗采用電位滴定法測定花椒中生物堿，用乙醇熱浸提法進行提取，正交試驗優(yōu)化提取工藝，旨在對花椒的進一步研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

花椒 南京市白下區(qū)石門坎蘇果超市；奎寧(對照品) 上海純優(yōu)生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、濃硫酸、乙醇、濃氨水、鄰苯二甲酸氫鉀等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 上海比朗儀器有限公司；干燥箱 南京實驗儀器廠；PHS-3C電位滴定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；電子天平 上海精密科學儀器有限公司；高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 樣品前處理

花椒放入烘箱中進行干燥，再將干燥后的花椒放入豆?jié){料理機中，粉碎至過40～60目篩，密封包裝后置于陰涼干燥處備用。

取樣品適量，用20倍石油醚進行脫脂處理。萃取3次，每次12 h。抽濾，取濾渣，風干備用。

2.2 溶液的配制及標定

2.2.1 溶液配制

0.02 mol/L H2SO4：取2 mL 98%濃硫酸, 定容至1000 mL，即得。

0.04 mol/L NaOH：取1.6 g NaOH粉末，溶于蒸餾水中，定容至1000 mL，即得。

2.2.2 溶液標定

2.2.2.1 NaOH溶液濃度的標定

準確稱取0.1～0.125 g鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)3份，分別于250 mL的錐形瓶中，加入50 mL的水使之溶解。再加酚酞指示劑2滴，用待標定的NaOH溶液滴定至溶液呈微紅色，30 s不褪色，即為終點。記錄所用NaOH溶液體積，計算NaOH標準溶液的濃度，并用Q檢驗法檢驗所得結果，最后計算結果的平均值和相對平均偏差。相對平均偏差應不超過0.2%，見表1。

表1 NaOH溶液濃度的標定Table 1 The calibration of NaOH solution concentration

公式：CNaOH=[mKHP/(M×V)]×1000，M=204.2 g/mol。

2.2.2.2 H2SO4溶液濃度的標定

用已標定的NaOH溶液進行標定，取3支錐形瓶，分別加入10 mL已標定的濃度為0.378 mol/L的NaOH溶液，再加入2滴甲基橙，用待標定的H2SO4溶液進行滴定至溶液由黃色變?yōu)槌壬礊榻K點，見表2。

表2 H2SO4溶液濃度的標定Table 2 The calibration of H2SO4 solution concentration

2.3 電位滴定法測定生物堿含量

2.3.1 花椒中生物堿的提取

稱取1 g干的花椒粉于錐形瓶中，加入20倍的70%乙醇，密封，稱重計數(shù)，于60 ℃恒溫水浴中浸提2 h；取出稱重，加乙醇至恒重；抽濾3次，取濾液；得到生物堿的抽濾液。

2.3.2 花椒中生物堿的測定

取上述待測濾液10 mL，加入20 mL已標定的H2SO4，將復合玻璃電極插入溶液中，選擇“mV”模式，開動攪拌器，用已標定的NaOH滴定，記錄電動勢mV變化和對應NaOH消耗量，儀器以mV值突躍判定滴定終點。將電動勢對NaOH消耗的體積作圖，再對電動勢求一階導數(shù)，一階導數(shù)對體積作圖，峰尖對應的值即是滴定終點[12]。電位滴定圖見圖1。

圖1 電位滴定圖Fig.1 Potentiometric titration

根據(jù)酸堿中和推出計算公式：生物堿含量(%)=[(CH2SO4×VH2SO4×2-CNaOH×VNaOH)/樣品質量]×M×100%， 即可求得生物堿的含量。

式中：CH2SO4為H2SO4濃度，mol/L；VH2SO4為H2SO4體積，L； CNaOH為NaOH濃度，mol/L；VNaOH為消耗NaOH的體積，L；M為花椒的生物堿(青花椒堿)相對分子量，257 g/mol。

由圖1可知，突躍點的NaOH消耗量為19.3 mL，則根據(jù)公式可以計算得：生物堿含量(%)=[(0.0193×0.02×2-0.0378×0.0193)/1]×257=1.09%。

因此，在料液比為1∶20，乙醇濃度為70%，提取溫度為60 ℃下提取3 h時的花椒中生物堿的含量為1.09%。

2.4 生物堿提取條件的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗

綜合對各種資料及文獻的參考及考慮，初步確定了影響花椒生物堿提取得率的4個重要因素，包括乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度。為了獲得每個因素的最佳工藝條件，必須先進行單因素試驗，固定其中3個因素不變，然后適當改變剩下1個因素的取值，在不同條件下進行試驗，并通過記錄數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，作圖計算出生物堿的提取得率。根據(jù)生物堿的不同提取得率，便可以得到每個因素的最佳條件，由于各提取條件對生物堿的提取得率都有很大的影響，為了測定每個因素單獨對提取得率的不同影響，進行4組單因素試驗。

2.4.1.1 提取溫度對花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍體積的70%乙醇，在60，70，80，90 ℃不同溫度下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法測定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)，作圖比較。

圖2 提取溫度對花椒中生物堿提取得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖2可知，在60～70 ℃之間隨著溫度的增加花椒中生物堿的提取得率也增加，但是超過70 ℃后花椒中生物堿的提取得率逐漸減少，尤其在80 ℃后提取得率明顯降低。所以確定選用60，70，80 ℃作為正交試驗的該因素3個水平。

2.4.1.2 乙醇濃度對花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍體積濃度為60%，70%，80%，90%的乙醇，分別在70 ℃下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法測定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)，作圖比較。

圖3 乙醇濃度對花椒中生物堿提取得率的影響Fig.3 Effect of different ethanol concentration on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖3可知，乙醇濃度對花椒總生物堿的提取率影響顯著。乙醇濃度過高或過低總生物堿的提取得率都會降低，當體積分數(shù)為70%時，提取率可高達1.61%，因此選擇70%，80%，90%乙醇作為正交試驗乙醇體積分數(shù)的3個水平。

2.4.1.3 提取時間對花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍體積70%的乙醇，在70 ℃下分別提取1.5，2，2.5，3 h，取出提取液，按照2.2.3方法測定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)， 作圖比較。

圖4 提取時間對花椒中生物堿提取得率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖4可知，提取時間延長生物堿的提取得率增大，最大可達1.70%，因為天然產物提取過程中提取時間的正確掌控對提取效果有重要影響，溶出平衡之前，隨時間延長溶出率增大。

2.4.1.4 料液比對花椒中生物堿提取得率的影響

分別稱取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，分別加入10，20，30，40倍體積的70%乙醇，在70 ℃下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法測定生物堿的含量。記錄數(shù)據(jù)，作圖比較。

圖5 料液比對花椒中生物堿提取得率的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由圖5可知，隨料液比的增大總生物堿的提取得率也增大，當料液比為1∶20時提取得率可高達1.61%，料液比為1∶20與1∶30的提取得率差異不大，說明1∶30的料液比就可以把生物堿基本提取完全。并且考慮到溶劑用量大、回收困難、節(jié)省成本的因素，因此選擇1∶10，1∶20，1∶30的料液比作為正交試驗料液比因素的3個水平。

2.4.2 正交試驗

在單因素基礎上，設計以下正交試驗。分別稱取1 g花椒9份，加入到已編號的9支250 mL三角瓶中，按照四因素三水平進行添加及條件控制。按照2.3.2方法測定生物堿的含量，記錄數(shù)據(jù)。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表3可知，最佳提取條件為B1A2C3D1，即在料液比為1∶10、乙醇濃度為80%、提取溫度為70 ℃、提取時間為3 h的條件下，對花椒的提取率最大，由極差分析可以看出，料液比為影響提取得率的重要因素，而提取溫度影響最小。

3 驗證試驗

通過正交試驗得到了生物堿的最優(yōu)工藝，為了驗證最優(yōu)組合的正確性，試驗在得到的最佳提取組合條件下，即在提取溫度70 ℃，乙醇體積分數(shù)為80%，提取時間3 h，料液比為1∶10的條件下重復試驗3次，進行驗證試驗。試驗數(shù)據(jù)見表4，驗證試驗的平均提取率為2.11%，與7號組合基本一致，說明了優(yōu)化試驗的合理性。

表4 驗證試驗結果Table 4 Results of verification experiment

4 結論

本研究采用熱浸提法提取花椒中的生物堿，并通過電位滴定法測定生物堿的含量。通過單因素試驗和正交試驗，確定了影響生物堿提取得率因素的主次順序，以及各項因素的最佳條件，并最終確定了提取的最佳工藝。通過正交試驗，生物堿的最佳提取條件為乙醇濃度80%、料液比1∶10、提取溫度70 ℃、提取時間3 h，在此條件下花椒中生物堿提取得率為2.11%。

通過對花椒中花色苷、生物堿的提取工藝進行研究，可為花椒進一步的藥理作用研究提供一定的理論依據(jù)。

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StudyonDeterminationMethodandExtractionTechnologyofZanthoxylumbungeanumAlkaloids

SHI Xue-ping

(School of Engineering and Technology,Jiangsu Vocational Institute of Commerce,Nanjing 210007,China)

The alkaloids are extracted by ethanol-water extraction and the content of alkaloids is determined by potentiometric titration. Through the single factor experiment, the optimum technological parameters for extracting alkaloids fromZanthoxylumbungeanumare determined, and the optimum extraction process is determined by orthogonal test.The results show that using the method of potentiometric titration, it is easy to find the titration end point. According to acid-base reaction, the content of alkaloid could be calculated. Using ethanol heating extraction method, the extraction technology of total alkaloids fromZanthoxylumbungeanumis studied by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum extraction conditions are:using 80% ethanol as extractant, material-liquid ratio is 1∶10, extraction temperature is 70 ℃, extraction time is 3 h.The optimum extraction rate of alkaloids by ethanol heating extraction method is 2.11%.

Zanthoxylumbungeanum;alkaloid;determination;extraction technology

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.022

1000-9973(2017)12-0101-05

2017-06-21

江蘇省自然科學基金面上項目(SBK201620404)

石雪萍(1974-)，女，河南南陽人，副研究員，研究方向：食品營養(yǎng)與檢測、功能性食品研究與開發(fā)。