趙慧君，沈馨，董蘊(yùn)，吳競(jìng)，凌霞，胡事成，郭壯*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北 襄陽 441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北 襄陽 441000)

襄陽大頭菜腌制液生物膜真菌多樣性研究

趙慧君1，沈馨1，董蘊(yùn)1，吳競(jìng)2，凌霞2，胡事成3，郭壯1*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北 襄陽 441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北 襄陽 441000)

采集了3 個(gè)襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品，使用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其真菌微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。在門水平上，Ascomycota平均含量高達(dá)99.99%，相對(duì)含量大于1%的真菌屬分別為Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其平均相對(duì)含量分別為56.10%，40.96%和2.32%。在分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)水平上，發(fā)現(xiàn)24 個(gè)核心OTUs，其中OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)的累計(jì)平均相對(duì)含量為83.60%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構(gòu)成，生物膜共有大量的核心真菌菌群。

襄陽大頭菜；生物膜；真菌；多樣性；Miseq

作為我國(guó)四大名腌菜之一的襄陽大頭菜是以芥菜為原料，采用獨(dú)特的“三腌、五鹵、六曬”工藝歷時(shí)18個(gè)月腌制而成，該制作工藝至今已有近2000年的歷史。因具有口感脆嫩、香味濃郁和歷史悠久的特點(diǎn)，2007年襄陽大頭菜被列為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，2009年又被列為湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[1]。襄陽大頭菜的腌制主要在腌制池或缸中進(jìn)行，長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月的腌制過程實(shí)質(zhì)上是微生物發(fā)酵、食鹽高滲透壓和蛋白質(zhì)分解等一系列生化反應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果，該過程賦予了大頭菜獨(dú)特的風(fēng)味和口感[2]。然而襄陽大頭菜的生產(chǎn)總體處于粗放式加工狀態(tài)，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會(huì)形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現(xiàn)，大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味，最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降直至失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。雖然將生物膜撈出后大量添加食鹽可以暫時(shí)延緩這一現(xiàn)象的再次發(fā)生，但生物膜一經(jīng)形成就很難控制和去除[3]。

16S rRNA和18S rRNA基因測(cè)序技術(shù)作為系統(tǒng)遺傳學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”方法[4]，長(zhǎng)期應(yīng)用于環(huán)境樣品微生物群體的物種組成和豐度研究中。以Miseq為代表的高通量測(cè)序技術(shù)采用宏基因組學(xué)的研究策略，通過將環(huán)境樣品中微生物的基因組混合作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，不僅揭示了微生物群體的物種組成及豐度信息，亦可以解析物種的生物功能，打破了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于純培養(yǎng)研究的局限性[5]。

本項(xiàng)目以表面長(zhǎng)生物膜大頭菜腌制液為研究對(duì)象，從宏基因組層面，以真菌18S rRNA基因全長(zhǎng)為Miseq測(cè)序靶點(diǎn)，在各系統(tǒng)分類學(xué)地位上對(duì)生物膜的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了揭示，以期為后續(xù)因產(chǎn)生生物膜而導(dǎo)致襄陽大頭菜品質(zhì)下降這一產(chǎn)業(yè)化問題的解決提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：購于德國(guó)QIAGEN公司；dNTPs Mix，5×TransStartTM，F(xiàn)astPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase：購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 1000 試劑盒：購于美國(guó)Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)AB公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；2100芯片生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；Miseq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北省襄陽孔明菜有限公司的腌制缸中采集長(zhǎng)生物膜的大頭菜腌制液樣品3份。樣品采集時(shí)，首先使用組織搗碎機(jī)將生物膜與腌制液攪拌均勻，然后立即置于4 ℃采樣箱內(nèi)，運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃冷凍儲(chǔ)存，48 h內(nèi)完成DNA的提取。

1.3.2 DNA提取

大頭菜腌制液3000 g 離心10 min后收集菌體，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA，繼而使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA的濃度和純度進(jìn)行測(cè)定，符合后續(xù)試驗(yàn)要求的DNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 真菌18S rRNA擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系為：5×PCR緩沖液4 μL，2.5 m MdNTPs mix 2 μL，5 μmol/L正向引物0.8 μL，5 μmol/L反向引物0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，體系用ddH2O補(bǔ)充至20 μL。其中真菌18S rRNA正向引物為SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')，其反向引物為SSU1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')，且在正向引物中加入7個(gè)核苷酸標(biāo)簽(barcode)。

擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格后，置-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 樣品平衡及Miseq高通量測(cè)序

使用2100芯片生物分析儀將每個(gè)樣品的DNA模板稀釋至100 nmol/L，混合均勻后寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.5 序列的拼接及質(zhì)控

按照以下流程進(jìn)行序列的拼接：根據(jù)成對(duì)序列之間的重疊關(guān)系，將雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列；根據(jù)barcode將所有序列劃分到各個(gè)樣品并對(duì)序列方向進(jìn)行校正；切掉序列barcode和引物。

若在序列拼接過程中存在以下情況則將該序列予以剔除：重疊區(qū)的堿基數(shù)小于10 bp；重疊區(qū)的最大錯(cuò)配比率大于0.2；barcode堿基錯(cuò)配；引物堿基錯(cuò)配數(shù)大于2 bp；切掉barcode和引物后若序列堿基數(shù)小于50 bp亦予以剔除。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(v1.7.0)分析平臺(tái)[6]對(duì)過控合格的序列按照以下流程進(jìn)行物種分析：

采用PyNAST[7]軟件將序列對(duì)齊；

以100%的相似度用UCLUST軟件[8]劃分序列得到無重復(fù)單一序列集，建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)；

以97%相似性使用UCLUST軟件進(jìn)一步劃分OTU；

從每條OTU選取1 條代表性序列，使用SILVA[9,10]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得門、綱、目、科、屬和OTU水平上各真菌的分類信息；

使用 FastTree 軟件[11]繪制基于 OTU 代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，計(jì)算香農(nóng)指數(shù) (Shannon index)、Observed Species(發(fā)現(xiàn)物種數(shù))和超 1 指數(shù) (Chao1 index)，進(jìn)而對(duì)襄陽大頭菜腌制液生物膜alpha多樣性進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7 核酸登錄號(hào)

本研究中所有Miseq序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，ID號(hào)為mgp79759。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的3 個(gè)腌制液生物膜樣品18S rRNA測(cè)序情況及各分類地位數(shù)量見表1。

表1 樣品18S rRNA測(cè)序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 Sample 18S rRNA sequencing and the number of taxonomic status

注：計(jì)算每個(gè)樣品Chao1和Shannon指數(shù)時(shí)，樣品的測(cè)序量均為30010條序列。

由表1可知，通過Miseq高通量測(cè)序，本研究采集的3 個(gè)樣品共產(chǎn)生了101882 條高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生33961 條。經(jīng)過100%序列鑒定聚類分析后，本研究共得到16833 條代表性序列，根據(jù)序列的97%相似性進(jìn)行操作分類單元?jiǎng)澐趾?，共得?3 個(gè)OTU，每個(gè)樣品平均51 個(gè)OTU。進(jìn)一步使用稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線對(duì)本研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量是否滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其結(jié)果見圖1。

圖1 稀疏曲線圖(A)和香農(nóng)指數(shù)曲線圖(B)Fig.1 Sparse curve (A) and Shannon index curve (B)

由圖1可知，隨著測(cè)序量的增加，稀疏曲線未進(jìn)入平臺(tái)期(A)而香農(nóng)指數(shù)曲線進(jìn)入了平臺(tái)期(B)，這說明隨著測(cè)序量的增加，新的種系型可能會(huì)被發(fā)現(xiàn)，但微生物的群落結(jié)構(gòu)不會(huì)再發(fā)生改變了，由此可見，本研究產(chǎn)生的序列數(shù)是可以滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求的。

2.2 基于不同分類地位核心菌群相對(duì)含量的分析

本研究使用SILVA數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU代表性序列進(jìn)行了同源性比對(duì)，所有的序列鑒定為2 個(gè)門、6 個(gè)綱、7 個(gè)目、8 個(gè)科和12 個(gè)屬，僅有0.006%的序列不能鑒定到屬水平。其中MBZ1和MBZ2樣品中僅發(fā)現(xiàn)Ascomycota這1 個(gè)真菌門，在MBZ3樣品中除Ascomycota外，亦發(fā)現(xiàn)了Basidiomycota，但其相對(duì)含量?jī)H為0.0063%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要隸屬于Ascomycota。如果某一真菌屬在3 個(gè)樣品中的平均相對(duì)含量大于1.0%，則將其定義為優(yōu)勢(shì)真菌屬。不同樣品中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量的比較分析見圖2。

圖2 襄陽大頭菜腌制液生物膜中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis of the relative content of dominant fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖2可知，納入本研究的3個(gè)腌制液生物膜樣品中優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其相對(duì)含量分別為56.10%，40.96%和2.32%，其他9個(gè)屬的相對(duì)含量累計(jì)為0.62%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構(gòu)成。徐婷等使用YPD培養(yǎng)基，采用純培養(yǎng)的方法從長(zhǎng)有生物膜的襄陽大頭菜鹵水中分離了1株酵母菌，并將其鑒定為Zygosaccharomycesrouxii。值得一提的是，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在泡菜[12]和葡萄酒[13]等發(fā)酵食品的制作過程中亦有生物膜現(xiàn)象的出現(xiàn)，類似的問題同樣影響了上述食品行業(yè)的發(fā)展。饒瑜等[14]對(duì)泡菜生物膜中真菌進(jìn)行了分離，研究表明Pichiakluyveri可以導(dǎo)致生物膜的形成。由此可見，Zygosaccharomyces下的真菌種可能具有致生物膜產(chǎn)生的作用。

如果某一個(gè)真菌屬在3個(gè)樣品中均存在，則本研究將其定義為核心菌屬，襄陽大頭菜腌制液生物膜中核心真菌屬的構(gòu)成及含量見圖3。

圖3 襄陽大頭菜腌制液生物膜中核心真菌屬的構(gòu)成及含量分析Fig.3 Analysis of the composition and content of core fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖3可知，Zygosaccharomyces，Pichia和Candida既為優(yōu)勢(shì)屬又為核心屬，除此之外，Phialosimplex亦為核心屬，其相對(duì)含量為0.60%。本研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了OTU在3個(gè)樣品中出現(xiàn)的次數(shù)，其結(jié)果見圖4。

圖4 OTU在襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.4 The number of times of occurrence of OTU in the samples of biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖4可知，3個(gè)襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品共產(chǎn)生93個(gè)OTU，然而在3個(gè)樣品中僅出現(xiàn)1 次的OTU為56個(gè)，占OTU總數(shù)的60.22%，所包含序列數(shù)為530條，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的0.52%。本研究每個(gè)樣品平均產(chǎn)生33960條序列，而每個(gè)樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU平均每個(gè)含有9.5條序列，則每個(gè)僅出現(xiàn)1次的OTU其包含序列的平均相對(duì)含量?jī)H為0.028%?；贠TU水平的Venn圖見圖5。

圖5 基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由圖5可知，MBZ1和MBZ2共有5個(gè)OTUs和21條序列，MBZ1和MBZ3共有4 個(gè)OTUs和60 條序列，MBZ2和MBZ3共有4 個(gè)OTUs和218條序列。雖然納入本研究的3個(gè)襄陽大頭菜生物膜樣品中共發(fā)現(xiàn)24個(gè)真菌的核心OTUs，占OTU總數(shù)的25.81%，但其包含101053條序列，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的99.19%。由此可見，雖然有的襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中可能含有一些較為獨(dú)特的種系型，但其相對(duì)含量是極低的，因而樣品共有大量的核心真菌菌群，核心OTU在3個(gè)襄陽大頭菜生物膜樣品中相對(duì)含量的熱圖見圖6。

圖6 核心OTU在各襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中相對(duì)含量的熱圖Fig.6 Heat map of the relative content of core OTU in biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

注：依據(jù)OTU的進(jìn)化關(guān)系建立了左側(cè)的系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖6可知，24個(gè)OTUs中，15個(gè)隸屬于Zygosaccharomyces，各有3 個(gè)隸屬于Pichia，Phialosimplex和Candida。值得一提的是，OTU62(Zygosaccharomyces)在3個(gè)樣品中的相對(duì)含量高達(dá)54.02%，51.23%和24.14%，而OTU37(Phialosimplex)相對(duì)含量高達(dá)33.07%，24.59%和63.74%，2個(gè)OTU的累計(jì)相對(duì)含量分別為87.09%，75.82%和87.88%，這也進(jìn)一步證實(shí)了雖然襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品共有大量的核心真菌菌群，但核心真菌菌群的多樣性相對(duì)較低，2個(gè)OTUs的相對(duì)含量就占到了真菌類群的80%左右。本研究進(jìn)一步對(duì)核心屬和核心OTU之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，其結(jié)果見圖7。

圖7 核心屬和平均相對(duì)含量大于1.0%的核心OTU相關(guān)性的熱圖Fig.7 Heat map of correlation among the core fungi genera (A) and OTU with relative content more than 1.0% (B)

注：依據(jù)相關(guān)系數(shù)建立左側(cè)和頂端聚類樹。

由圖7可知，4個(gè)核心真菌屬之間相關(guān)性均不顯著(P>0.05)，除OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)外，OTU86(Candida)的平均相對(duì)含量也大于1.0%，然而3 個(gè)OTU之間亦均無相關(guān)性(P>0.05)。

3 結(jié)論

襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構(gòu)成，雖然有的樣品中可能含有一些較為獨(dú)特的種系型，但生物膜樣品共有大量的核心真菌菌群。

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StudyontheDiversityofFungalMicrofloraofBiomembraneinXiangyangMustardRootBrine

ZHAO Hui-jun1, SHEN Xin1, DONG Yun1, WU Jing2, LING Xia2, HU Shi-cheng3, GUO Zhuang1*

(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food, College of Chemical Engineering and Food Science, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China; 2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision, Xiangyang 441021, China; 3.Xiangyang Kongmingcai Co.,Ltd ., Xiangyang 441000, China)

In the current study, 3 biomembrane samples of Xiangyang mustard root brine are collected, and the fungal microbiota are studied by Miseq high throughput sequencing technologies.Ascomycotais the most dominant fungal phylum with the relative abundance of 99.99%. At the phylum level,Zygosaccharomyces,PichiaandCandidaare constituting more than 1% of total sequences, with the relative abundance of 56.10%, 40.96% and 2.32% respectively. At the OTU level,24 OTUs are shared by all samples, and the cumulative average relative content of OTU62(Zygosaccharomyces)and OTU37(Phialosimplex)is 83.60%. The results indicate that the fungal microbiota of biomembrane in Xiangyang mustard root brine are main consisted byZygosaccharomycesandPichiabelong toAscomycota, and biomembrane samples have a large number of core fungal flora.

Xiangyang mustard root；biomembrane；fungus；diversity；Miseq

TS255.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.013

1000-9973(2017)12-0061-05

2017-07-15 *通訊作者

湖北省食品藥品監(jiān)督管理局科研項(xiàng)目(201601025)；襄陽市科技計(jì)劃研究與開發(fā)項(xiàng)目(2016)；湖北文理學(xué)院食品新型工業(yè)化學(xué)科群建設(shè)項(xiàng)目(2017)

趙慧君(1979-)，女，講師，博士，研究方向：食品生物技術(shù)；

郭壯(1984-)，男，副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。