孫國滔，劉萬卉

（煙臺大學(xué)，山東 煙臺 264005）

對復(fù)方?jīng)鲅w粒質(zhì)量控制方法的研究

孫國滔，劉萬卉?

（煙臺大學(xué)，山東 煙臺 264005）

目的：探討復(fù)方?jīng)鲅w粒的鑒別及含量測定方法，確定該方的質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜法（TLC）對復(fù)方?jīng)鲅w粒中的金銀花、紫草、苦參及牡丹皮進(jìn)行鑒別。采用高效液相色譜法（HPLC）對該方中的黃芩苷進(jìn)行含量測定。結(jié)果：采用TLC可對復(fù)方?jīng)鲅w粒中的金銀花、紫草、苦參及牡丹皮進(jìn)行鑒別。采用HPLC對該方中的黃芩苷進(jìn)行含量測定時，黃芩苷在0.017 6～0.352 0μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9）。結(jié)論：采用TLC和HPLC對復(fù)方?jīng)鲅w粒進(jìn)行鑒別和含量測定可靠、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)。TLC和HPLC可作為復(fù)方?jīng)鲅w粒的質(zhì)量控制方法。

復(fù)方?jīng)鲅w粒；TLC；HPLC；質(zhì)量控制

復(fù)方?jīng)鲅w粒由黃芩、金銀花、白鮮皮及牡丹皮等11味中藥組成。該方是從《溫病條辨》中的“清營湯”化裁而來的，其組方合理，且具有清熱解毒、涼血止血的功效。我國古代的醫(yī)家常用該方治療以身熱夜甚、神煩少寐、時有譫語、目常喜開或喜閉、口渴或不渴、斑疹隱隱、脈數(shù)、舌絳而干為表現(xiàn)的熱入營血證。為了更好地控制復(fù)方?jīng)鲅w粒的質(zhì)量，以保障該藥使用的安全，本文采用薄層色譜法（TLC）對該方中的金銀花、紫草、苦參及牡丹皮進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對該方中的黃芩苷進(jìn)行含量測定?，F(xiàn)將具體情況報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 試驗儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀、VWD檢測器、Agilent 1100化學(xué)工作站（由美國安捷倫科技公司生產(chǎn))、KQ-100型超聲波清洗器（由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）、BS210S電子天平（由北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)）、ZF-2型三用紫外燈（由上海市安亭電子儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 試驗用藥

金銀花、苦參、牡丹皮、紫草、綠原酸（批號：110753-200413）、 苦 參堿（ 批 號 ：110805-200508）、丹皮酚（批號：110708-200506）、黃芩苷（批號：110715-200514）、甲醇（色譜純）、純凈水（品牌：娃哈哈）。其他試劑均為分析純。上述的藥材均購于長春市藥材公司，均符合《中國藥典》2010年版第一部中的相關(guān)規(guī)定。金銀花、苦參、牡丹皮、紫草的對照藥材（其批號分別為：121060-200906、121019-200106、121490-200501、121430-200802）購于中國食品藥品檢定研究院。

2 對金銀花、紫草、苦參及牡丹皮進(jìn)行TLC鑒別

2.1 金銀花

取5 g的金銀花，將其用20ml的水溶解，用乙酸乙酯對該溶液進(jìn)行2次振搖提取，每次提取20ml。將提取的溶液蒸干，在所得的殘渣中加入1ml的甲醇使其溶解。將該溶解液作為供試品溶液。取1 g金銀花的對照藥材，按照供試品溶液的制備方法將其制成對照藥材溶液。取適量的綠原酸對照品，將其與甲醇混合（混合液的濃度為每1ml的甲醇中含有1mg的綠原酸對照品），將該溶液作為對照品溶液。按照TLC[1]試驗的要求，分別吸取10 μl的供試品溶液、10 μl的對照藥材溶液和10 μl的對照品溶液，將其點在硅膠G薄層板上，用乙酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5，V/V/V）上層溶液作為展開劑將其展開、取出、晾干，然后放置在紫外燈（波段為365 nm）下進(jìn)行檢視。供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液的色譜若都在相應(yīng)的位置上，并顯示相同顏色的熒光斑點，說明陰性樣品無干擾。

2.2 紫草

取2 g的紫草，將其研成細(xì)末后用20ml的乙酸乙酯溶解，用超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz）對該溶液進(jìn)行15min的提取，然后將提取液濾過，將所得的濾液濃縮至1ml。將該濃縮液作為供試品溶液。取0.5 g紫草的對照藥材，按照供試品溶液的制備方法將其制成對照藥材溶液。按照TLC[1]試驗的要求，分別吸取5 μl的供試品溶液和5 μl的對照藥材溶液，將其點在硅膠G薄層板上，用環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（3：5：0.5：0.1，V/V/V/V）作為展開劑將其展開、取出、晾干，然后放置在紫外燈（波段為365 nm）下進(jìn)行檢視。供試品溶液與對照藥材溶液的色譜若都在相應(yīng)的位置上，并顯示相同顏色的斑點，說明陰性樣品無干擾。

2.3 苦參

取2 g的苦參，將其研成細(xì)末后用25ml的三氯甲烷和0.5ml的氨水溶解，用超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz）對該溶液進(jìn)行30min的提取，然后將提取液濾過，將所得的濾液蒸干。在蒸干后向所得的殘渣中加入1ml的三氯甲烷使其溶解。將該溶液作為供試品溶液。取1 g苦參的對照藥材，按照供試品溶液的制備方法將其制成對照藥材溶液。取適量的苦參堿對照品，將其與甲醇混合（混合液的濃度為每1ml的甲醇中含有0.2mg的苦參堿對照品）。將該溶液作為對照品溶液。按照TLC[1]試驗的要求，分別吸取6 μl的供試品溶液、6 μl的對照藥材溶液和6 μl的對照品溶液，將其點在硅膠G薄層板上，用甲苯-乙酸乙酯-丙酮 -濃氨水（2：5：3：0.4，V/V/V/V)作為展開劑將其展開、取出、晾干。向薄層板上先后噴碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液，然后將其放置在紫外燈（波段為365 nm）下進(jìn)行檢視。供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液的色譜若都在相應(yīng)的位置上，并顯示相同顏色的斑點，說明陰性樣品無干擾。

2.4 牡丹皮

取2 g的牡丹皮，將其研成細(xì)末后放入20ml的乙醚中浸泡5min。用超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz）對該溶液進(jìn)行10min的提取，然后將提取液濾過，將所得的濾液揮干。在揮干后向所得的殘渣中加入2ml的丙酮使其溶解。將該溶液作為供試品溶液。取1 g牡丹皮的對照藥材，按照供試品溶液的制備方法將其制成對照藥材溶液。取適量的丹皮酚對照品，將其與丙酮混合（混合液的濃度為每1ml的丙酮中含有2.5mg 的丹皮酚對照品）。將該溶液作為對照品溶液。按照TLC[1]試驗的要求分別吸取8 μl的供試品溶液、8 μl的對照藥材溶液和8 μl的對照品溶液，將其點在硅膠G薄層板上，然后用乙酸乙酯-環(huán)己烷-冰醋酸（1：4： 0.1，V/V/V）作為展開劑將其展開、取出、晾干。向薄層板上噴酸性為5%的三氯化鐵乙醇溶液，并加熱薄層板，然后將其放置在紫外燈（波段為365 nm）下進(jìn)行檢視。供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液的色譜若都在相應(yīng)的位置上，并顯示相同顏色的斑點，說明陰性樣品無干擾。

3 對黃芩苷進(jìn)行HPLC含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil（鉆石）C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（48：52，V/V）；流速：1.0ml·min-1；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μl。進(jìn)行等梯度洗脫，按黃芩苷峰計算理論塔板數(shù)（應(yīng)不低于2500）。HPLC色譜圖如下所示：

HPLC色譜圖

3.2 供試品溶液的制備

取10g的黃芩苷，將其研成細(xì)末。精密稱取0.5 g的黃芩苷細(xì)末，將其加入平底燒瓶中。精密量取50ml濃度為70%的乙醇，將其加入平底燒瓶中。用超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz）對上述的混合液進(jìn)行30min的提取。待提取液放冷后稱定其重量，并用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，然后將提取液搖勻、濾過。將本次所得的濾液作為供試品溶液。

3.3 對照品溶液的制備

精密稱取8.80mg干燥的黃芩苷對照品，將其置入100ml量瓶中。向該量瓶中加入甲醇，定容至刻度，然后將混合液搖勻。精密量取2ml黃芩苷與甲醇的混合液，將其置入10ml的量瓶中。向該量瓶中加入甲醇，定容至刻度，然后將該溶液搖勻，得到對照品溶液。對照品溶液的濃度應(yīng)為 0.017 6mg·ml-1。

3.4 陰性對照品溶液的制備

取缺少黃芩的陰性模擬處方，按工藝方法對其進(jìn)行提取，得到干浸膏。精密稱取0.5 g的干浸膏，按供試品溶液的制備方法對其進(jìn)行制備，得到陰性對照品溶液。

3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取 1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20 μl的對照品溶液（0.017 6mg·mL-1），將其注入液相色譜儀，記錄其峰面積。以峰面積的峰值為縱坐標(biāo)，以黃芩苷的量為橫坐標(biāo)繪制曲線，并計算出回歸方程。y=76.916x+3.694 2，r =0.999 9（n=6）。試驗結(jié)果表明，黃芩苷在0.017 6～0.352 0 μg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

3.6 重現(xiàn)性試驗

精密稱取6份同一批次的黃芩苷樣品，將其制備成供試品溶液，然后按照3.1中給出的色譜條件測定其峰面積，并計算出黃芩苷的含量。RSD=1.39%（n=6）。試驗結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性良好。

3.7 精密度試驗

用重現(xiàn)性試驗中的第一份黃芩苷樣品溶液作為供試品。精密吸取10 μl的供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定黃芩苷的峰面積，并計算出結(jié)果。RSD=0.87%（n=6）。試驗結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗

用重現(xiàn)性試驗中的第一份黃芩苷樣品溶液作為供試品，按照3.1中給出的色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h時進(jìn)樣，記錄其峰面積，并計算出結(jié)果。RSD=1.45%（n=5）。試驗結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3.9 回收率試驗

采用加樣回收法取6份已知含量、同一批次的黃芩苷樣品，精密稱定其重量后，分別加入1ml濃度為1.6050mg·ml-1的黃芩苷對照品溶液，然后按照3.3中給出的供試品溶液制備方法將其制成供試品溶液，并按照3.1中給出的色譜條件進(jìn)行測定，計算其回收率。具體的計算結(jié)果見表1：

表1 回收率計算結(jié)果 （n=6）

4 三批黃芩苷樣品的含量測定結(jié)果

對三批黃芩苷樣品進(jìn)行含量測定，每批樣品測定兩個平行樣。具體的結(jié)果見表2：

表2 對三批黃芩苷樣品進(jìn)行含量測定的結(jié)果

5 討論

5.1 定性鑒別

對復(fù)方?jīng)鲅w粒中的金銀花、紫草、苦參及牡丹皮按照各自的檢查方法進(jìn)行TLC鑒別，結(jié)果顯示其均具有良好的重復(fù)性和可行性。

5.2 含量測定

在進(jìn)行黃芩苷含量測定時，筆者在查閱文獻(xiàn)[1-5]的基礎(chǔ)上，對甲醇-水-磷酸流動相的比例做過多次配比試驗。結(jié)果顯示，用甲醇-0.4%磷酸（50：50）作為流動相時，被測色譜峰的峰型較好、保留時間適中，且分離度也能滿足試驗的要求。

5.3 提取方法

本文參考了中國藥典中黃芩及黃芩制劑中黃芩苷含量的測定方法，比較了不同提取溶劑（包括濃度為70%的乙醇及甲醇)、不同提取方法（包括超聲處理和加熱回流提取）、不同超聲處理時間（分別為10min、15min和30min)等因素對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，用濃度為70%的乙醇作為溶劑、進(jìn)行30min的超聲處理，即可使樣品中的黃芩苷被完全提取。

綜上所述，采用TLC和HPLC對復(fù)方?jīng)鲅w粒進(jìn)行鑒別和含量測定可靠、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)。TLC和HPLC可作為復(fù)方?jīng)鲅w粒的質(zhì)量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部) [S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]藍(lán)鳴生,等.高效液相色譜法測定復(fù)方百部止咳沖劑中的黃芩苷含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17 (6):958.

[3]廖偉明,劉桂珍,周國波. HPLC法測定小兒止咳顆粒中黃芩苷的含量[J].中國藥房,2010,21(31):2946.

[4]龍艷華.黃菊顆粒中黃芩的有效成份黃芩苷的含量測定[J].中國藥師,2006,9(7):646.

[5]馬艷,袁慧星,岳莉,等.咽炎丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥房,2009,20(33):2610.

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2095-7629-（2017）12-0126-02

孫國滔，男，1982年出生，碩士研究生在讀，研究方向為藥物分析，E-mail：sgt3771@163.com.com

＊通訊作者：劉萬卉，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向為藥物分析