胡丹丹，李 磊，孟艷秋，寧偎鋒

（沈陽化工大學(xué)，遼寧 沈陽 110142）

淺論葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的制備及其靶向性

胡丹丹，李 磊，孟艷秋，寧偎鋒

（沈陽化工大學(xué)，遼寧 沈陽 110142）

目的：探討葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒（Folate-BSANP）的制備及其靶向性。方法：利用去溶劑化法制備白蛋白納米粒（BSANP），再于堿性的環(huán)境下利用葉酸活性脂與BSANP表面的氨基反應(yīng)，制得Folate-BSANP。以熒光定量法測定納米粒的濃度、粒徑、培育的時(shí)間、游離葉酸對(duì)腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP的影響程度。結(jié)果：隨著納米粒濃度的增加、粒徑的增大，培養(yǎng)時(shí)間的延長及腫瘤細(xì)胞外游離葉酸含量的減少，腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP的速率逐漸加快。結(jié)論：Folate-BSANP可通過腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，明顯靶向于葉酸受體豐富的腫瘤細(xì)胞。

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒；制備；靶向性

惡性腫瘤是目前全球致死率最高的疾病，是導(dǎo)致人類死亡的三大疾病之首（其余兩種疾病為心臟病和腦卒中）。傳統(tǒng)治療惡性腫瘤的方法如放療和化療，靶向性較低，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)殺傷健康細(xì)胞，治療的有效率和安全性均較低。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，臨床上逐漸采用生化調(diào)節(jié)劑聯(lián)合化療并以介入治療的新型療法治療惡性腫瘤，以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞和減少副作用的目的[1]。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細(xì)胞（如肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、骨癌細(xì)胞等）的細(xì)胞膜上均存在較多的葉酸受體。這為利用葉酸受體對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向給藥提供了基礎(chǔ)[2]。在本次研究中，筆者主要探討Folate-BSANP的制備及其靶向性。

1 材料與方法

1）儀器：FA1204B電子分析天平，UV752N紫外可見分光光度計(jì)[3]，馬爾文激光粒度測試儀，透射電子顯微鏡，熒光分光光度計(jì)，CO2恒溫培養(yǎng)箱，細(xì)胞粉碎超聲機(jī)，恒溫磁力攪拌器，臺(tái)式水浴恒溫振蕩器，熒光顯微鏡。2）試劑：牛血清蛋白（BSA），葉酸( Sigma)，胰蛋白酶，二環(huán)己基碳二亞胺( Acros)，N-羥基琥珀酰亞胺( Sigma)，異硫氰酸熒光素( Sigma)，人腎癌786-0細(xì)胞，無葉酸細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)等。

2 方法

2.1 BSANP的制備

首先稱量白蛋白100mg，加入1ml的水進(jìn)行溶解，放入25℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌2 h，將溶液的pH值調(diào)至8～9。使用恒流泵將4ml濃度為95%的乙醇溶液在8min內(nèi)緩慢地加入到上述溶液中，并在其中加入濃度為8%的戊二醛溶液20 μl，在室溫下進(jìn)行交聯(lián)固化反應(yīng)。固化完畢后繼續(xù)攪拌溶液。攪拌完成后，靜置12 h。12 h后，在轉(zhuǎn)速為15000 r/min的離心機(jī)中進(jìn)行10min的離心處理，傾去上清液，加水恢復(fù)至其原來的體積，再進(jìn)行10min的超聲處理，即得到BSANP膠體溶液。

2.2 葉酸活性脂的制備

將0.5ml的三乙胺緩慢地加入到20ml的二甲亞砜溶液中，靜置10min左右使其冷卻。在冷卻好的二甲亞砜溶液中加入1mg的葉酸粉末，用玻璃棒緩慢攪拌使其充分溶解。在溶液 中加入適量的二環(huán)己基碳二亞胺和 N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫的條件下充分反應(yīng)12 h。對(duì)上述溶液進(jìn)行過濾，經(jīng)減壓和濃縮處理后，使其成為干燥的粉末狀物質(zhì)。用乙醚將溶液中的剩余雜質(zhì)析出，得到淡黃色的粉末。該淡黃色粉末即為葉酸活性脂[4]。

2.3 Folate-BSANP的制備

取適量BSANP膠體混懸液，用緩沖溶液將混懸液的pH值調(diào)至9。將之前制備好的淡黃色粉末（葉酸活性脂）溶解，加入到混懸液中，攪拌均勻。用葡萄糖凝膠柱對(duì)上述混懸液進(jìn)行上柱分離，收集先留下來的有白色光亮部分的液體，即可得到Folate-BSANP膠體混懸液。

2.4 BSANP和Folate-BSANP的粒徑大小與分布測定

在25℃的室溫條件下，取兩種膠體溶液（BSANP膠體溶液和Folate-BSANP膠體溶液）適量，分別于其中加入1 l的蒸餾水，然后運(yùn)用馬爾文激光粒度測試儀分別測試BSANP與Folate-BSANP的粒徑大小及其分布。

2.5 Folate-BSANP偶聯(lián)葉酸程度的測試

測定5批Folate-BSANP 胰蛋白酶水解液在358 nm處的吸光度，在相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可得到單位質(zhì)量BSA上偶聯(lián)葉酸的量，并采用2-三硝基苯磺酸顯色法、4-三硝基苯磺酸顯色法以及6-三硝基苯磺酸顯色法[5]測定BSANP表面活性氨基的含量。

2.6 腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的實(shí)驗(yàn)

采用人腎癌786-0細(xì)胞作為模型細(xì)胞，用熒光素對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，以熒光定量的方法考察人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的情況。細(xì)胞培養(yǎng)的方法：取人腎癌786-0細(xì)胞適量，接種到24孔板上，每孔約有5×103個(gè)細(xì)胞。接種24 h后，更換培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，用由200ml/L的小牛血清配置的培養(yǎng)基對(duì)人腎癌786-0細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

2.6.1 測試納米粒濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響 在預(yù)培養(yǎng)的人腎癌786-0細(xì)胞中分別加入不同濃度的Folate-BSANP膠體混懸液與BSANP膠體混懸液1.5ml，培養(yǎng)2.5 h。

2.6.2 測試培育時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞攝取 Folate-BSANP與BSANP的影響 在預(yù)培養(yǎng)的人腎癌786-0細(xì)胞培養(yǎng)孔中分別加入濃度為0.5mg/ml的Folate-BSANP膠體混懸液與BSANP膠體混懸液各1ml，分別培養(yǎng)0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h和 4 h。

2.6.3 測試游離葉酸對(duì)腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響 在預(yù)培養(yǎng)的人腎癌786-0細(xì)胞培養(yǎng)孔中分別加入含有游離葉酸的濃度為0.5mg/ml的Folate-BSANP膠體混懸液與BSANP膠體混懸液各1ml，培養(yǎng)4 h。4 h后，用冷磷酸緩沖液對(duì)用上述方法培養(yǎng)的人腎癌786-0細(xì)胞進(jìn)行洗滌1min，再將細(xì)胞破碎，運(yùn)用熒光粉光度計(jì)測定細(xì)胞溶解液的熒光（λex= 480 nm λem=530 nm）。

2.6.4 對(duì)腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的定性觀察 取人腎癌786-0細(xì)胞懸液適量，分別將其鋪在載玻片上。在其中分別加入濃度相同的Folate-BSANP混懸液與BSANP混懸液，培養(yǎng)4 h。用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖液對(duì)人腎癌786-0細(xì)胞進(jìn)行洗滌，然后固定人腎癌786-0細(xì)胞。運(yùn)用熒光顯微鏡觀察并記錄腫瘤細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的情況。

3 結(jié)果

3.1 Folate-BSANP與BSANP的形態(tài)、粒徑大小及分布情況

用透射電子顯微鏡觀察Folate-BSANP與BSANP，結(jié)果顯示兩種納米粒均呈圓形，形態(tài)均十分完整，且大小均勻。運(yùn)用激光散射法測定BSANP的平均粒徑為62 nm，其中超過90%的BSANP 其粒徑小于121 nm。Folate-BSANP的平均粒徑為 68 nm，其中超過90%的Folate-BSANP其粒徑小于129 nm，其粒徑比BSANP的粒徑略大。

3.2 Folate-BSANP偶聯(lián)葉酸程度的測定

在5批Folate-BSANP樣品中，表面葉酸偶聯(lián)量的測定值分別為 171 μmol/g、175 μmol/g、163 μmol/g、164 μmol/g、172 μmol/g BSA,其平均葉酸偶聯(lián)量為169 μmol/gBSA。采用2-三硝基苯磺酸顯色法、4-三硝基苯磺酸顯色法及6-三硝基苯磺酸顯色法測定BSANP表面活性氨基的含量為598 μmol/g BSA，則偶聯(lián)于Folate-BSANP表面的葉酸密度為28.4%。

3.3 納米粒的濃度和培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響

隨著培養(yǎng)液中Folate-BSANP質(zhì)量濃度的增加，人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP的量逐漸遞增。但當(dāng)Folate-BSANP的質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/ml后，人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP的速率會(huì)逐漸降低。人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP的量遠(yuǎn)大于攝取BSANP的量。在極低質(zhì)量濃度時(shí)，人腎癌786-0細(xì)胞對(duì)Folate-BSANP與BSANP的攝取量幾乎為零。詳見圖1。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP的量逐漸增加，且在初始的2 h內(nèi)細(xì)胞的攝取量增加較為迅速，在隨后的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)增加較為緩慢。詳見圖2。

3.4 游離葉酸對(duì)人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響

隨著外源性葉酸的加入，人腎癌786-0細(xì)胞對(duì)Folate-BSANP的攝取量會(huì)逐漸減少，最終接近BSANP的攝取量。人腎癌786-0細(xì)胞攝取BSANP的曲線十分平緩。

3.5 比較人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP的量與攝取BSANP的量

將人腎癌786-0細(xì)胞與Folate-BSANP混合并在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)3 h后，在熒光顯微鏡下可以看到明顯的熒光。將人腎癌786-0細(xì)胞與BSANP混合并在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)3 h后，在熒光顯微鏡下基本上看不到熒光。這說明人腎癌786-0細(xì)胞攝取Folate-BSANP的量遠(yuǎn)大于攝取BSANP的量。

4 討論

大多數(shù)受體本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)。受體多存在于靶器官的質(zhì)膜上或核內(nèi)胞液中。與受體特異性結(jié)合能夠傳遞信息的信號(hào)分子叫配體。不同的配體只能與其相應(yīng)的受體結(jié)合，從而激活細(xì)胞的信息傳遞功能，使細(xì)胞的功能改變。受體和配體的結(jié)合具有特異性、飽和性、親和力強(qiáng)、結(jié)合速度快等多種特性。利用分子生物技術(shù)將配體作為藥物或某些小分子物質(zhì)的載體，用藥物將其包埋，通過受體和配體結(jié)合介導(dǎo)的作用，將藥物直接送達(dá)所在受體的靶細(xì)胞或靶器官，從而可達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。這種方法具有起效快、療效確切及毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。由于葉酸受體在多種癌細(xì)胞膜上均具有較高的表達(dá)性，且葉酸受體介導(dǎo)的BSANP具有分子體積小和表面親水性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此其可以逃脫巨噬細(xì)胞的吞噬而直接作用于靶器官。

[1]趙潔,夏亞丹,劉艷艷. 葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]山東醫(yī)藥,2015,55(22):97-100.

[2]Sudimack, Lee RJ.Targeted drug delivery via the folatereceptor [J].Adv Drug Deliv Rev9,2000,41(2):147.

[3]Li Lei,Zhao Xiuli,Yang Chunrong,et al.Preparation and optimization of doxorubicin-loaded albumin nanoparticles using respon se surface methodology[J]. Drug Development & Industrial Pha rmacy,2011,37(10):1170-1180.

[4]RJ Lee,PS Low.Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis [J].J Biol Chem,1994,269(5):3198.

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R739.53

B

2095-7629-（2017）12-0002-03

遼寧省科技廳博士科研啟動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目，（20141083）；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目，（L2016023）

胡丹丹，女，1991年10月出生，山東新泰市人，碩士，沈陽化工大學(xué)學(xué)生，研究方向：主動(dòng)靶向納米?？拱┧?；李磊，男，1981年10月出生，黑龍江大慶人，博士，沈陽化工大學(xué)教師，研究方向：藥物新劑型的研究；孟艷秋，女，1963年8月出生，遼寧省錦州人，博士，沈陽化工大學(xué)教授，研究方向：天然活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造及抗腫瘤活性研究；寧偎鋒，男，1990年10月出生，安徽省宿州人，碩士，沈陽化工大學(xué)學(xué)生，研究方向：主動(dòng)靶向納米?？拱┧?/p>