顧 芳，汪慎燚，秦宜德

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥 230032)

微型制備型電泳比較從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)的3種方法

顧 芳，汪慎燚，秦宜德

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥 230032)

為探索建立適用于從人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中提取蛋白質(zhì)的最優(yōu)化方法，通過培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，分別采用Pull-Down Lysis、RIPA裂解法和加有硫脲的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )分析，然后使用微型制備型電泳分離蛋白，根據(jù)色譜圖上的吸收峰比較從人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)的3種方法。結(jié)果表明：不同方法提取人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3總蛋白的豐度及色譜圖存在差異，Pull-Down Lysis 試劑法在分離相對(duì)分子質(zhì)量為15～80 kDa的蛋白質(zhì)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。3種方法中以Pull-Down Lysis 試劑法為人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法，與微型制備型電泳的兼容性更好。

蛋白質(zhì)提取； SKOV3細(xì)胞； 制備型電泳； 優(yōu)化方法

0 引 言

凝膠電泳和毛細(xì)管電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的分析領(lǐng)域[1-2]。但是，由于電泳技術(shù)不易放大，有關(guān)制備型電泳技術(shù)的研究報(bào)道很少[3-5]。1997年，Cole 等利用設(shè)計(jì)的一套可在線收集樣品的制備型電色譜裝置，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物的分離[6-7]。本實(shí)驗(yàn)所用的微型制備型電泳為美國BIO-RAD公司生產(chǎn)，它將凝膠電泳、毛細(xì)管電泳技術(shù)及色譜分析技術(shù)相結(jié)合，能快速、有效地分離核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子。它能分離相對(duì)分子質(zhì)量差別僅有2%的蛋白，通過非變性PAGE膠純化等電點(diǎn)只相差0.1pH單位的蛋白。但它對(duì)樣品的質(zhì)量要求比較高，因此樣品的制備是制備型電泳分析中最重要的環(huán)節(jié)，它直接影響后續(xù)的研究分析。

本文實(shí)驗(yàn)以人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3為對(duì)象，比較3種不同的蛋白質(zhì)提取方法，即Pull-Down Lysis、RIPA裂解法和加有硫脲的細(xì)胞裂解液法，了解不同裂解液的提取蛋白效率以及它們與制備型電泳的兼容性，從而建立SKOV3細(xì)胞總蛋白的相對(duì)最優(yōu)提取方法。

1 材料與方法

1.1材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)液購自美國GIBCO 公司,胎牛血清購于杭州四季青公司。胰蛋白酶、丙酮酸鈉和谷氨酰胺均購自美國 AMRESCO 公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，超聲破碎儀是美國Sonics。微型制備型電泳購于美國BIO-RAD公司，型號(hào)為Mini Prep Cell。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。待單細(xì)胞層接近匯合時(shí)，用0.1%的胰酶(含0.1 mol/L EDTA)消化，分別以 5×104個(gè)/mL的密度接種于直徑為100 mm的3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取蛋白質(zhì)(此時(shí)每皿細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×107個(gè))。

1.3細(xì)胞總蛋白的提取

Pull-Down Lysis 試劑法：用胰酶消化后離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS洗滌細(xì)胞3次，加Pull-Down Lysis試劑(1 mL每1×107個(gè)細(xì)胞)，在冰上靜置裂解30 min，期間顛倒混勻數(shù)次，4 ℃、12 000g離心20 min后，取上清儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

RIPA裂解法 ：離心收集胰酶消化的細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS 洗細(xì)胞3次，然后加500 μL RIPA，RIPA buffer中加入PMSF 5 μL放于冰上靜置裂解30 min。超聲(180 W)10次，每次10 s，間隔 10 s，最后以4 ℃，12 000g離心20 min后，取上清儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

硫脲裂解法(參照 Herman 等[8]的方法) ：離心收集到的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗2次后，在1×107個(gè)細(xì)胞中加含硫脲裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，現(xiàn)加 65 mmol/L DDT)1 mL。放于冰上靜置裂解30 min，再超聲180 W，每次工作10 s，間隔10 s，最后以4 ℃，12 000g離心20 min，取上清儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.4蛋白質(zhì)定量

采用Bradford法[9-11]定量，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蛋白濃度。

1.5聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用SDS-PAGE非連續(xù)變性電泳檢測(cè)：12%濃度的分離膠，4%濃度的濃縮膠，沸水浴5 min后上樣。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.6微型制備型電泳分析

采用Native-PAGE[12]非變性膠:10%濃度的下層膠，4%濃度的上層膠。分別取含30 μL上述方法提取的總蛋白質(zhì)液與上樣緩沖液混合，用注射器穿過上槽緩沖液的液面,將樣品緩緩加到微型制備型電泳儀的膠面，將電源調(diào)制恒流6 mA,啟動(dòng)電源，并接通核酸蛋白檢測(cè)儀和自動(dòng)部分收集器。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及蛋白質(zhì)含量、濃度的對(duì)比分析

由圖1可知，牛血清白蛋白濃度與吸收度A在0～0.8 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為：Y=0.815X-0.810(R2=0.992)。由此對(duì)3種蛋白提取方法得到的蛋白質(zhì)含量及濃度對(duì)比分析見表1。

圖1 牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 3種提取蛋白方法蛋白質(zhì)含量及濃度比較

從表1可見，3種提取蛋白方法從蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)濃度上看，Pull-Down Lysis 試劑法優(yōu)于細(xì)胞裂解法和硫脲裂解法。

2.2蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分析

在細(xì)胞數(shù)相同、不同方法提取蛋白后終體積相同、 電泳上樣體積相同的條件下，電泳結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，蛋白質(zhì)帶型基本不變，但泳道2所示蛋白質(zhì)條帶著色較深，蛋白質(zhì)含量較高；泳道1和泳道3蛋白質(zhì)條帶著色淺，蛋白質(zhì)含量較低，其結(jié)果與蛋白質(zhì)含量及濃度計(jì)算相吻合。進(jìn)一步表明Pull-Down Lysis 試劑法適合作為SKOV3細(xì)胞總蛋白的提取方法。

1-RIPA裂解法；2-Pull-Down Lysis試劑法；3-硫脲裂解法圖2 3種方法提蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

2.3微型制備型電泳分析

樣品通過微型制備型電泳分離由核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)到的吸收峰經(jīng)HD-A電腦采集器分析結(jié)果如下：圖3(b)出峰數(shù)及峰面積均高于圖3(a)及圖3(c)。出峰時(shí)間圖3(c)晚于圖3(a)及圖3(b)，圖3(a)的出峰時(shí)間稍早于圖3(b)，基本一致,表明樣品濃度不同出峰時(shí)間會(huì)有差別。

(a) RIPA裂解法

(b) Pull-Down Lysis試劑法

(c) 硫脲裂解法圖3 3種方法提取總蛋白的吸收峰色譜圖

3 結(jié) 論

本研究所用的微型制備型電泳是一種設(shè)計(jì)精巧的核酸蛋白樣品分離純化系統(tǒng)。它的功能就是從樣品中分離純化出目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)核酸。樣品在柱狀膠中進(jìn)行電泳，蠕動(dòng)泵給予樣品洗脫以動(dòng)力，帶動(dòng)樣品從凝膠柱中流出，流出的樣品被分子截留膜截留后，經(jīng)過陶瓷冷卻棒中心的管道流經(jīng)紫外檢測(cè)儀，最后為自動(dòng)部分收集器收集以便進(jìn)行后續(xù)研究。電泳儀的電泳液經(jīng)循環(huán)泵和陶瓷冷卻棒，保持一定溫度，保證樣品條帶平行地洗脫，并可以最大限度地確保在用非變性膠分離純化樣品的過程中，保持樣品活性。

樣品的質(zhì)量是微型制備型電泳分析中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，直接影響制備型電泳的分辨率和可靠性。本研究采取了3種從SKOV3細(xì)胞中提取總蛋白的方法，發(fā)現(xiàn)相比其他兩種方法，Pull-Down Lysis 試劑法步驟少，操作簡(jiǎn)單快速，蛋白質(zhì)得率高。RIPA裂解法是比較常用的提取蛋白的方法，含有高效去垢劑成分1%NP-40,可以破壞脂質(zhì)雙分子層[13]。硫脲是高效率的變性劑，能溶于高濃度的尿素溶液，從而改善疏水性膜蛋白的溶解性。提取液中所加的 CHAPS 是兼性分子，不帶凈電荷，能溶于高濃度的尿素溶液，可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的溶解性[14-15]。但RIPA裂解法和硫脲裂解法解法提取蛋白的步驟相對(duì)較多、耗時(shí)比較長，可能會(huì)引起蛋白的降解。從制備型電泳分離的色譜圖看，Pull-Down Lysis試劑法在分離相對(duì)分子質(zhì)量為15～80 kDa的蛋白質(zhì)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，色譜圖分辨率更高結(jié)果重復(fù)性好，有利于后續(xù)的蛋白質(zhì)研究和分析。當(dāng)然該試劑的分離純化效率與樣品來源關(guān)系密切，所以需針對(duì)來源不同的樣本探索選擇適宜的提取方法。

通過本實(shí)驗(yàn)，3種方法中以Pull-Down Lysis 試劑法為SKOV3 細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法，與微型制備型電泳的兼容性更好。

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ComparisonofThreeProteinExtractionMethodsbyMiniPreparativeElectrophoresis

GUFang，WANGShenyi，QINYide

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China)

Protein extraction from tissue or cells is an important step to effect high-resolution protein separation by preparative electrophoresis.Three protein extraction methods were compared in order to determine an optimal one for human ovarian cancer cell line SKOV3.The three methods including Pull-Down Lysis kit, RIPA lysis buffer and Thiourea lysis buffer were adopted to extract the total protein from human ovarian cancer cell line SKOV3.The protein concentration was determined by Bradford protein assay for calculation of the protein yield, and then the protein samples were separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis(SDS-PAGE)and preparative electrophoresis.Data showed the protein yielded by the method of using Pull-Down Lysis kit is high.The Pull-Down Lysis method generated the best resolution in which most proteins with molecular weight from 15 kDa to 80 kDa were distributed.Experiment showed that the Pull-Down Lysis method has the best protein solubilization ability in three protein extraction methods．

protein extraction; SKOV3 cells; mini preparative electrophoresis; optimization mathod

R 34

A

1006-7167(2017)10-0021-03

2017-01-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472448) ；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1508085MH196)

顧 芳(1978-)，女，安徽合肥人，博士生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樯锘钚噪募皩?shí)驗(yàn)教學(xué)與管理。Tel.：13855120256; E-mail：wsxgf2013@163.com

秦宜德(1962-)，男，安徽合肥人，博士，教授，研究方向?yàn)樯锘钚噪摹el.：0551-65161131;E-mail：qinyide@hotmail.com