倪 敏，劉婷婷，顧海東，潘 楊，李 祥

(蘇州科技大學(xué) 江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

活性污泥中氨氧化菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品制備方法的比較

倪 敏，劉婷婷，顧海東，潘 楊，李 祥

(蘇州科技大學(xué) 江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

為了快速準(zhǔn)確地檢測(cè)活性污泥中氨氧化菌(AOB)的拷貝數(shù)，探求一種新的快速簡(jiǎn)便的絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。利用純化的PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行絕對(duì)定量，比較兩者熔解曲線、擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對(duì)拷貝數(shù)等方面的差異，分析兩種標(biāo)準(zhǔn)品制備方法應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)。結(jié)果顯示，兩種標(biāo)準(zhǔn)品制備的熔解曲線都呈單一尖峰、擴(kuò)增曲線指數(shù)期平行、標(biāo)準(zhǔn)曲線R2gt;99%，PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品得到的AOB絕對(duì)拷貝數(shù)小于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果(Plt;0.05)，表明純化的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品較制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品而言，操作過程更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、對(duì)人員專業(yè)要求更低，在其純度較高的情況下，具有和重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品一樣的應(yīng)用效果。

氨氧化菌； 絕對(duì)定量； PCR產(chǎn)物； 重組質(zhì)粒； 腐殖酸

0 引 言

環(huán)境樣品中微生物數(shù)量眾多且成分復(fù)雜，突變和進(jìn)化導(dǎo)致的16S rRNA保守序列有所不同。氨氧化菌(AOB)是一種與土壤微生物功能豐度相關(guān)的細(xì)菌，對(duì)污水中相關(guān)參數(shù)的沖擊敏感，被認(rèn)為是硝化的限速步驟[1]。研究其含量對(duì)控制和提高污水處理過程中脫氮的穩(wěn)定運(yùn)行具有重要意義[2]，氨氧化菌進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的分析方法主要分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量[3-5]。相對(duì)定量無恒定的管家基因，難以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[6]。絕對(duì)定量較為準(zhǔn)確，也是目前環(huán)境微生物基因水平定量研究的首選。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備是絕對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)方法是將待測(cè)基因的目的片段克隆到質(zhì)粒中，測(cè)定重組質(zhì)粒濃度、計(jì)算其拷貝數(shù)，稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品[7]。這種制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的方法需要經(jīng)過純化PCR產(chǎn)物、測(cè)序、連接T-載體、制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、搖菌、抽提質(zhì)粒等一系列復(fù)雜過程，該過程耗時(shí)長(zhǎng)、人員操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高[8-10]。而PCR產(chǎn)物經(jīng)兩輪膠回收純化，模板純度和質(zhì)量已得到優(yōu)化，作為實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品是否能夠替代質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品去檢測(cè)AOB基因的絕對(duì)拷貝數(shù)，沒有報(bào)道。

本文以文獻(xiàn)報(bào)道的構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品的技術(shù)為參照，研究了純化的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，定量活性污泥AOB基因應(yīng)用的可行性，探討純化的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用特點(diǎn)，為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備提供新的有效方法。

1 材料與方法

1.1AOB的富集培養(yǎng)

參照北京工業(yè)大學(xué)申請(qǐng)的發(fā)明專利[11]，其中恒溫32 ℃；溶解氧0.5～1 mg/L進(jìn)行富集培養(yǎng)。

1.2引物設(shè)計(jì)

利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，氨氧化細(xì)菌AOB16S rRNA和M13通用引物序列如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.3DNA的抽提及瓊脂糖凝膠電泳

活性污泥DNA提取采用美國(guó)MP公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒FastDNA Spin kit for soil，MP-116560?；旌螪NA提取后的3個(gè)平行樣品，降低提取過程的操作誤差。利用核酸蛋白測(cè)定儀NanoDrop2000檢測(cè)基因組的A260/230、A260/280和濃度。2%的瓊脂糖凝膠，95 V電泳35 min，檢測(cè)基因組抽提的完整性及質(zhì)量。

1.4PCR擴(kuò)增及膠回收

0.2 mL PCR管中配置20 μL的體系如下：0.2 μL TaKaRa Taq (5 U/mL)，2 μL 10×PCR Buffer (Mg2+Plus)，2 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，2μL模板DNA (10 ng/μL)，1 μL上游引物(10 nmol/L)，1 μL下游引物(10 nmol/L)、滅菌蒸餾水加至20 μL。將上述反應(yīng)液離心、混勻、再離心在PCR儀中進(jìn)行以下循環(huán)：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系溫度最后降至4 ℃，待分析。

1.5制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品[12-13]

按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0的操作說明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化(AOB基因產(chǎn)物長(zhǎng)度491 bp)。以回收的PCR產(chǎn)物為模板，以相同條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠、回收，將第二次回收的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。每次回收后，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定回收PCR產(chǎn)物的A260/230、A260/280和濃度，重復(fù)3次。第一次回收的PCR產(chǎn)物，按照pGEM-T Easy Vector Systems試劑盒的說明書進(jìn)行與載體連接、轉(zhuǎn)化。按照質(zhì)粒快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的操作說明書進(jìn)行質(zhì)粒的提取，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。利用DNA樣品和純水作參照，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和PCR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的A260/230、A260/280和濃度，測(cè)定重復(fù)3次。根據(jù)下式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和PCR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)：

DNA拷貝數(shù)(copies/μL)=

(6×1023×CDNA×10-9)/MW

式中：M代表拷貝DNA分子的堿基對(duì)數(shù)，bp/copy；W代表1個(gè)堿基對(duì)的道爾頓，660 Daltons/bp；CDNA為DNA濃度，ng/μL。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及AOB基因的檢測(cè)。10倍系列稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和抽提的待測(cè)樣品基因組為模板，定量檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)組分為：Mix 12.5 μL、P1和P2各0.58 μL、重組質(zhì)粒DNA 2 μL、滅菌三蒸水9.5 μL。反應(yīng)條件同常規(guī)PCR，總延伸結(jié)束后，加入熔解曲線的制備(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)步驟。以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸，循環(huán)數(shù)Ct值為y軸做回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法同上。

(2) 定量結(jié)果分析。以抽提樣品基因組為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，所得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出兩種標(biāo)準(zhǔn)品制備方法中AOB的絕對(duì)拷貝數(shù)(copies/g)。

2 結(jié)果與討論

2.1PCR產(chǎn)物兩次膠回收后濃度和質(zhì)量

土壤樣品成分復(fù)雜，腐殖酸、蛋白質(zhì)、酚類等都會(huì)影響DNA的質(zhì)量和純度，兩次膠回收后PCR產(chǎn)物的濃度和質(zhì)量見表2，第二次PCR產(chǎn)物回收后的A260/230平均值0.62顯著高于第一次的0.18 (Plt;0.05)，這可能與樣品中較多的腐殖酸殘留有關(guān)[16-18]。第一次和第二次PCR產(chǎn)物回收后，A260/280平均值分別為1.30和1.64，第二輪純化減少了雜質(zhì)的殘留，提高了PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，為PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品提供了可能。兩次純化后PCR產(chǎn)物的純度仍然與高質(zhì)量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(見表2)有一些差距[7]，兩次純化后的PCR產(chǎn)物是否可作為標(biāo)準(zhǔn)品，有待進(jìn)一步的研究。

表2 兩次膠回收后PCR產(chǎn)物的濃度和質(zhì)量

2.2擴(kuò)增曲線

為了研究PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品是否能夠替代質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，將兩種標(biāo)準(zhǔn)品和樣品AOB基因分別進(jìn)行絕對(duì)定量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，每組擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，低濃度樣本指數(shù)期明顯，曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，基線平直或略微下降，無明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)，曲線整體平行性好，說明每組定量PCR各管的擴(kuò)增效率一致，兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線適用于待測(cè)樣品基因的定量。

2.3熔解曲線

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品-PCR產(chǎn)物和樣品AOB基因

(b) 標(biāo)準(zhǔn)品-質(zhì)粒和樣品AOB基因圖1 擴(kuò)增曲線

(a)標(biāo)準(zhǔn)品?PCR產(chǎn)物和樣品AOB基因(b)標(biāo)準(zhǔn)品?質(zhì)粒和樣品AOB基因

圖2 熔解曲線

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品AOB基因拷貝數(shù)

為了研究標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的Ct值與模板的拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系是否符合絕對(duì)定量的要求，根據(jù)兩組定量結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。表3中PCR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2分別為99.80%和99.60%，符合文獻(xiàn)報(bào)道的范圍[7]。PCR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率E分別為83.47%和104.66%，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線E值在合理的范圍內(nèi)[19]，表明模板、酶、雜質(zhì)等各因素對(duì)擴(kuò)增的抑制作用非常?。籔CR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線E值稍低，這可能與表1顯示的回收PCR產(chǎn)物中模板的純度稍低有關(guān)，Taq酶對(duì)腐殖酸較為敏感，模板中殘留的腐殖酸可能抑制了定量PCR反應(yīng)[20]。根據(jù)式(1)計(jì)算兩種標(biāo)準(zhǔn)品絕對(duì)定量的起始拷貝數(shù)，代入圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系式中，得到樣品AOB基因的拷貝數(shù)，結(jié)果見表3。兩組絕對(duì)定量AOB基因的拷貝數(shù)分別為：6.36×1015copies/g，3.42×1015copies/g (Plt;0.05)，結(jié)果差異顯著，這與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量和純度有關(guān)。說明在樣品雜質(zhì)較多，腐殖酸含量較高時(shí)，PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對(duì)定量的結(jié)果比質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品偏小。

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品-PCR產(chǎn)物和樣品AOB基因

(b) 標(biāo)準(zhǔn)品-質(zhì)粒和樣品AOB基因圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 AOB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)和拷貝數(shù)

3 結(jié) 語(yǔ)

PCR產(chǎn)物通過兩次膠回收純化后，質(zhì)量和純度有很大的提高，可能由于腐殖酸的殘留，標(biāo)準(zhǔn)品-PCR產(chǎn)物絕對(duì)定量AOB的拷貝數(shù)低于標(biāo)準(zhǔn)品-質(zhì)粒的結(jié)果。對(duì)于缺乏內(nèi)參基因，DNA純度較高的樣品，PCR產(chǎn)物可作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對(duì)定量；對(duì)于雜質(zhì)較多，特別是腐殖酸含量較高的樣品，傳統(tǒng)的制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對(duì)定量的擴(kuò)增效率較為理想，穩(wěn)定性更高，結(jié)果更準(zhǔn)確。

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AComparativeStudyoftheStandardPreparationMethodsofReal-timeFluorescenceQuantitativePCRofAmmoniaOxidizingBacteriainActivatedSludge

NIMin，LIUTingting，GUHaidong，PANYang，LIXiang

(Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering; School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, Jiangsu, China)

To detect the copy number of ammonia oxidizing bacteria (AOB) of activated sludge rapidly and accurately, and to explore an easy preparation method of absolute quantitative PCR standard, this study used purified PCR product and preparative recombinant plasmid, respectively, to conduct absolute quantification PCR (AQ-PCR).The melting curve, amplification curve, standard curve and differences of absolute copy number were compared, the advantages of the two standard preparation method were analyzed.The results showed that the two melting curves of preparation standard were a single peak, the index phases of the amplification curves were parallel,R2values of standard curves were more than 99%, the AOB absolute copy number of PCR product as a standard was less than the results of recombinant plasmid standard (Plt;0.05).It indicates the purification of PCR products as a standard is more convenient, more economic, and lower personnel professional requirements than the recombinant plasmid standard.In the case of the high purity, PCR product has the same application effect with recombinant plasmid standard.

ammonia oxidizing bacteria(AOB); absolute quantification; PCR product; recombinant plasmid; humic acid

Q 89；X 703.1

A

1006-7167(2017)10-0017-04

2017-02-03

國(guó)家研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC0401103)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51478284，51408387)；蘇州市分離凈化材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SZS201512)；江蘇省高等教育教改研究項(xiàng)目(2015JSJG248)

倪 敏(1989-)，女，安徽阜陽(yáng)人，實(shí)驗(yàn)師，現(xiàn)主要從事微生物去氮除磷理論及工藝研究。Tel.：0512-68092510；E-mail: nimin@mail.usts.edu.cn

李 祥(1984-)，男，江蘇儀征人，實(shí)驗(yàn)師，現(xiàn)主要從事廢水脫氮處理理論及工藝研究。Tel.：0512-68786192；E-mail: lixiang@mail.usts.edu.cn