石詠梅 馬英民 廖 君 易亞喬 余清平 黃 娟 葛金文

(湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院解剖教研室，湖南 長沙 410208)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK通路在腦泰方提取物保護局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元中的作用

石詠梅 馬英民1廖 君 易亞喬2余清平 黃 娟3葛金文3

(湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院解剖教研室，湖南 長沙 410208)

目的探討中藥復方腦泰方(NTF)提取物(NTE)對局灶性腦缺血的治療作用及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 PERK通路的干預作用。方法自備NTE連續(xù)灌胃7 d后，在體制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，觀察術(shù)后大鼠的神經(jīng)行為,同時使用Nissl染色觀察神經(jīng)元凋亡情況，使用免疫組織化學、Western及RT-qPCR觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果NTE對大鼠腦缺血后的行為有一定的改善作用；NTE可明顯增加MCAO后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活。NTE從術(shù)后12 h開始抑制PERK通路p-PERK的表達，明顯促進GRP78蛋白的表達，抑制術(shù)后CHOP蛋白的表達,尤其在術(shù)后24 h。RT-qPCR結(jié)果顯示NTE可以顯著降低MCAO術(shù)后72 h海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)CHOP的表達。結(jié)論NTE對腦缺血具有治療作用，其可能的機制是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK通路，尤其是在腦缺血的早期。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；缺血；海馬；神經(jīng)元；PERK；腦泰方

研究顯示〔1～4〕，腦缺血引起的細胞損傷，一般集中體現(xiàn)在線粒體損傷、缺血區(qū)遲發(fā)性細胞死亡、鈣離子超載、自由基損傷等方面。腦組織一旦缺血，生成的自由基、ATP損耗、鈣離子超載均會造成高爾基體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細胞器結(jié)構(gòu)功能變化。同時，細胞器出現(xiàn)應激后，可以將其作為判定腦損傷程度的黃金標準。在真核細胞中〔5〕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在，主要負責分泌、合成、轉(zhuǎn)運、加工蛋白；并且，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能夠使鈣離子保持平衡，具有非常重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還是運轉(zhuǎn)、質(zhì)控、折疊蛋白的中心細胞器，能夠通過調(diào)解體積適應細胞的合成、代謝等生理需求。缺氧、缺血、應激、低氧等狀態(tài)，有可能引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失調(diào)。

本文擬研究益氣活血方對局灶性腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1動物 湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心成年且健康的SD大鼠120只，重量220～250 g，雄性。

1.2藥物制備及使用方法 復方腦泰方提取物(NTE)：由黃芪、川芎、地龍和僵蠶組成，用2 500 ml浸泡4～6 h后，文火煎煮，提純后得到膏粉。使用前，同生理鹽水調(diào)成高、中、低三個濃度，即每200 ml生理鹽水中分別加入15.42 g、7.71 g、3.86 g NTF。治療前，使用尼莫地平進行對照，將其配制成濃度3.2 mg/ml。各組均于術(shù)前7 d開始每天1次按每100 g大鼠1 ml使用灌胃法給予相應藥物，模型組給予生理鹽水(NS)。

1.3動物模型 根據(jù)腦部結(jié)構(gòu)制作模型。仰臥位，按照頸部中線切開，注入麻醉藥物，然后在距離左側(cè)頸總動脈(CCA)4 mm處切開一個小口，將栓線插入到頸內(nèi)動脈(ICA)，插入深度為(22±0.5)mm。神經(jīng)行為學評分判斷造模是否成功。模型成功大鼠分別于術(shù)后6、12、24、48、72 h取材，進行相關(guān)形態(tài)學和分子生物學檢測。

1.4實驗方法

1.4.1神經(jīng)行為學評分 采用Longa評分法,0分，無障礙；1分，前肢無法前傾；2分，可以向一側(cè)翻轉(zhuǎn)；3分，可以向一側(cè)傾倒；4分，無自主活動。

1.4.2Nissl 染色 常規(guī)麻醉，灌注，取大腦半球置于4℃4%多聚甲醛中固定。冰凍切片置于75%酒精浸泡，沖洗后置于0.1% Nissl染液中10～15 min(鏡下觀察決定染色時間)，鏡下觀察。

1.4.3免疫組織化學 石蠟切片脫蠟，復水，按試劑盒說明進行實驗。顯微鏡下觀察葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78和c/EBP家庭同源蛋白(CHOP)的表達情況，染色陽性反應物為棕黃色顆粒。

1.4.4Western印跡 活體取大鼠海馬，加入5倍體積緩沖液勻漿，離心取上清，蛋白濃度用Lowry法蛋白定量；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,點樣順序依次是模型組術(shù)后6 h(M6)、12 h(M12)、24 h(M24)、48 h(M48)及NTE組術(shù)后6 h(NTE6)、12 h(NTE12)、24 h(NTE24)和48 h(NTE48)。免疫檢測:加封閉液1 h，依次加入一抗和二抗，電化學增強發(fā)光法(ECL)免疫檢測試劑盒進行顯色，曝光，照相。結(jié)果采用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)分析，得出相應的IOD值和與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)的比值。蛋白表達量與IOD值呈正相關(guān)。

1.5RT-qPCR檢測相關(guān)基因的表達 提取RNA進行逆轉(zhuǎn)錄;1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度;測RNA濃度;第一鏈cDNA合成;real-time PCR檢測(Bio-Rad CFX Connect)。引物序列見表1。檢測所得CT值利用2-△△CTlivak 方法計算目的基因的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件行單因素方差分析。

表1 CHOP及β-actin擴增引物序列

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)行為學評分 中劑量〔(2.1±0.28)分〕和高劑量〔(1.8±0.09)分〕NTE可以顯著降低MCAO后大鼠的神經(jīng)行為學評分,模型組評分(2.8±0.45)分，低劑量NTE組為(2.2±0.31)分，尼莫地平組為(2.0±0.24)分。提示NTE可以明顯改善缺血后大鼠的自主行為能力，促進功能的恢復。

2.2Nissl 染色 使用NTE后，單位面積內(nèi)大鼠海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量〔低、中、高劑量組分別為(23.2±3.16)、(25.6±0.45)、(30.8±2.65)個〕與模型組〔(12.5±1.14)個〕相比顯著提高(Plt;0.05)；尼莫地平組神經(jīng)元數(shù)量為(27.5±1.57)個。見圖1。

2.3免疫組織化學 GRP78陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，模型組自術(shù)后6 h表達水平逐步上調(diào)，至24 h達高峰，72 h后顯著下調(diào)；使用NTE干預后，術(shù)后GRP78表達明顯上調(diào)，至72 h表達水平仍然顯著高于模型組。見圖2。CHOP陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于神經(jīng)元胞核內(nèi)。模型組自術(shù)后6 h表達水平逐步上調(diào)，24 h表達顯著上調(diào)并維持在高水平，72 h后表達又進一步明顯上調(diào)。使用NTE干預后術(shù)后24 h表達水平顯著低于模型組。見圖2，圖3。

2.4Western印跡檢測結(jié)果 使用NTE后缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元 CHOP的表達顯著低于模型組，尤其是在術(shù)后24 h；GRP78的表達顯著高于模型組；而p-PERK的表達在術(shù)后12 h開始明顯低于模型組。見圖4，表2。

2.5RT-qPCR結(jié)果 與模型組相比，在MCAO后6 h和12 h，NTE組CHOP mRNA的相對表達量較高,48 h后開始下降，72 h后顯著降低。見圖5。

圖1 MCAO術(shù)后72 h Nissl染色(×400)

圖2 MCAO術(shù)后24 h免疫組化檢測各組GRP78表達(DAB，×400)

圖3 MCAO術(shù)后72 h免疫組化檢測各組CHOP表達(DAB，×400)

組別p-PERKGRP78CHOPM6組0.08±0.000.10±0.0041)0.76±0.071)M12組0.14±0.011)0.25±0.031)0.92±0.091)M24組0.14±0.011)0.34±0.051)1.08±0.081)M48組0.16±0.011)0.15±0.011)0.94±0.071)NTE6組0.13±0.010.43±0.070.67±0.02NTE12組0.10±0.000.39±0.060.56±0.03NTE24組0.09±0.000.44±0.050.55±0.03NTE48組0.10±0.000.25±0.030.56±0.04

與同時間點NTE組比較：1)Plt;0.05

1～9依次為：NTE6、NTE12、NTE24、NTE48、M6、M12、M24、M48、空白對照組圖4 Western印跡檢測p-PERK、GRP78、CHOP蛋白表達

與同時間點NTE組比較：1)Plt;0.05圖5 模型組、NTE組CHOP mRNA表達

3 討 論

一般情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶會和三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的ERS應激早期激活未折疊蛋白反應(UPRER)蛋白相融合，從而讓其失去活性。ERS早期激活PERK，PERK(PKR-like ER kinase)即蛋白激酶樣ERS激酶，是一次跨膜的ERS駐留蛋白質(zhì),與肌醇需求激酶(IRE)1相類似，同屬于Ⅰ型跨膜蛋白。其N端位于ERS腔，C端位于細胞質(zhì)，包括一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。其腔內(nèi)的應激感應結(jié)構(gòu)域在生物起源上有一定的關(guān)聯(lián),而且結(jié)構(gòu)和功能也相類似。有實驗已經(jīng)證明〔6〕，兩者可以互換，以降低細胞負載。ERS是磷酸被激活形成的活性形式〔7〕，p-PERK作用于真核細胞翻譯起始因子eIF2α，具有抑制翻譯效果，減輕細胞負擔。然而，現(xiàn)如今的研究資料顯示，如果應激現(xiàn)象一直存在，會導致ERS死亡(ERAD)，也就是細胞凋亡。

ERS與癌癥、代謝紊亂、感染性疾病、骨質(zhì)疏松和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(帕金森病)密切相關(guān)〔8〕。進一步的研究表明腦缺血性疾病、腦的缺血再灌注損傷也與ERS相關(guān)〔9，10〕。在局灶性腦缺血后，海馬神經(jīng)元PERK通路蛋白表達出現(xiàn)了明顯變化。首先,在腦缺血的早期，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)就有明顯的GRP78表達，缺血24 h后表達量最高。隨后表達逐步下調(diào)。使用NTE干預后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)GRP78表達明顯上升。Min等〔11〕發(fā)現(xiàn)使用2-脫氧-D-葡萄糖后缺血再灌注大鼠神經(jīng)元GRP78的表達在12 h后顯著上調(diào)。其次,缺血引起海馬神經(jīng)元內(nèi)PERK的活化(p-PERK),這種作用可以在術(shù)后12 h被NTE所抑制。PERK的活化是ERS的一條重要途徑〔12〕，Gu等〔13〕發(fā)現(xiàn)川芎和赤芍的混合提取物能夠通過抑制ERS通路蛋白PERK及其下游蛋白eIF2α和CHOP的表達進而起到抑制MCAO術(shù)后大鼠基底前腦神經(jīng)元凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PERK激活導致的神經(jīng)元CHOP表達也可被NTE下調(diào)，然而CHOP蛋白和基因表達被抑制的時間卻并不相同，這還需要進一步的實驗去探討。Cao等〔14〕發(fā)現(xiàn)申脈散的提取物益氣復脈(YQFM)粉可以抑制ERS通路標志蛋白CHOP的表達。滋陰補脾藥物血清能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(主要是通過抑制CHOP的表達)引起的神經(jīng)元凋亡〔15〕。

綜上所述，NTE對腦缺血具有治療作用，其可能的機制是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK通路，尤其是在腦缺血的早期。

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〔2017-05-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

R741

A

1005-9202(2017)22-5512-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.012

國家自然科學基金委員會青年項目(No.81303078)；湖南省教育廳項目(No.13C699)；湖南省中醫(yī)藥管理局項目(No.201593)資助

1 長沙市中心醫(yī)院耳鼻喉科

2 湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院仲景教研室

3 湖南中醫(yī)藥大學中西結(jié)合學院

葛金文(1965-)，男，教授，博士后，博士生導師，主要從事腦血管病的中醫(yī)藥防治研究。

石詠梅 (1979-)，女，在讀博士，講師，主要從事腦血管病的中醫(yī)藥防治研究。