葛衛(wèi)力 米亞非 朱 敏 陸抑非 李 濤 江建軍

(溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 臺州 317000)

轉(zhuǎn)化生長因子β1對老年心房顫動患者內(nèi)皮細胞向間質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響

葛衛(wèi)力 米亞非 朱 敏1陸抑非 李 濤 江建軍

(溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 臺州 317000)

目的探討轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1對老年心房顫動患者內(nèi)皮細胞向間質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響。方法選擇老年陣發(fā)性心房顫動患者100例及持續(xù)性心房顫動患者100例，分離循環(huán)血內(nèi)皮細胞，將其分為對照組〔加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)培養(yǎng)〕和TGF-β1組(加入TGF-β1 10 ng/ml培養(yǎng))。采用MTT實驗測定細胞增殖，transwell實驗測定細胞遷移，免疫熒光染色觀察CD31和vimentin表達，Western印跡法測定CD31、vimentin、ve-cadherin和α-平滑肌肌動蛋白(SMA)含量。結(jié)果TGF-β1組吸光度A值明顯低于對照組(Plt;0.05)，穿膜細胞數(shù)高于對照組(Plt;0.05)。免疫熒光染色顯示：和對照組比較，TGF-β1組間質(zhì)細胞特異性蛋白vimentin表達明顯升高、內(nèi)皮細胞特異性蛋白CD31表達明顯降低；對照組含極少vimentin和CD31雙陽性細胞，TGF-β1組vimentin和CD31雙陽性細胞明顯增多。Western印跡檢測結(jié)果顯示，TGF-β1組CD31和ve-cadherin明顯低于對照組(Plt;0.05)，間質(zhì)細胞標志性蛋白vimentin和α-SMA明顯高于對照組(Plt;0.05)。結(jié)論TGF-β1可誘導老年心房顫動患者內(nèi)皮細胞向間質(zhì)化細胞轉(zhuǎn)化。

心房顫動；內(nèi)皮細胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1；心肌纖維化

心房顫動是最常見的心律失常類型，在老年人中多見，多數(shù)心房顫動患者早期呈陣發(fā)性，隨著疾病的發(fā)展，最后轉(zhuǎn)化為持續(xù)性心房顫動，心房顫動增加腦卒中和死亡的危險。和非心房顫動患者比較，心房顫動患者的心房組織纖維化和膠原增生更嚴重〔1〕，成纖維細胞增殖并分泌膠原蛋白是心肌纖維化和心肌重構(gòu)的基礎(chǔ)。心房顫動患者存在內(nèi)皮系統(tǒng)功能異常，在間質(zhì)纖維化過程中，內(nèi)皮細胞-間質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要作用〔2～4〕。本文觀察轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1對老年心房顫動患者內(nèi)皮細胞向間質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑 選擇溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院2013年1月至2014年12月70歲以上老年心房顫動患者200例，包括陣發(fā)性心房顫動患者100例和持續(xù)性心房顫動患者100例，并選擇性別、年齡相匹配的健康體檢者100例作為對照組。所有入選者簽署知情同意書，經(jīng)我院倫理委員會審批。排除標準：資料不全者、慢性阻塞性肺疾病者、起搏器攜帶者、曾行心房顫動消融治療者，合并中重度瓣膜疾病者，原發(fā)性甲狀腺功能亢進或減退者，3個月內(nèi)有心肌病、心肌炎、急性冠狀動脈綜合征、心肌梗死史者，惡性腫瘤者，糖尿病、高血壓、高脂血癥和動脈粥樣硬化，近期服用激素或抗炎藥物者，近期有感染史或手術(shù)外傷史者。主要試劑：Dylight熒光二抗、Hochest33342、鼠抗人CD31抗體、兔抗人vimentin抗體、兔抗人ve-cadherin抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2研究方法 心房顫動組抽取入院第2天空腹外周靜脈血。循環(huán)血內(nèi)皮細胞分離和鑒定：將3 ml抗凝循環(huán)血用Hanks稀釋1倍，經(jīng)Percon密度梯度離心法分離并收集細胞，移至細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞達80%左右融合時進行傳代培養(yǎng)，取第4代細胞進行實驗。鑒定：在24孔板上制細胞爬片，封閉后加入兔抗人血管性血友病因子(vWF)相關(guān)抗原過夜孵育，加入Hochest33342核染，加入Dylight熒光二抗孵育，顯微鏡下觀察。細胞分組：將細胞分為對照組和TGF-β1組，TGF-β1組加入TGF-β1 10 ng/ml，對照組加入等量PBS液。細胞增殖實驗：將兩組細胞接種到96孔板中(每孔1×105個細胞)，每組設(shè)7個復孔，培養(yǎng)12 h、饑餓24 h，加入TGF-β1或PBS液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入MTT試劑放置2.5 h，酶標儀測量490 nm吸光度A值。細胞遷移實驗：將兩組細胞接種到24孔板中(每孔5×104個細胞)，每組設(shè)7個復孔，培養(yǎng)12 h、饑餓24 h，加入TGF-β1或PBS液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，在transwell小室上室加入細胞懸液100 μl，下室加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，培育24 h后多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后計數(shù)穿膜細胞數(shù)。免疫熒光染色：在24孔板上制細胞爬片，每組設(shè)7個復孔，培養(yǎng)48 h后固定封閉，加入vWF、CD31、vimentin、ve-cadherin、α-SMA一抗過夜孵育，加入Hochest 33342核染，加入熒光二抗孵育，熒光顯微鏡下觀察單染情況；免疫熒光雙染步驟和單染步驟相同，一抗為CD31和vimentin混合一抗。兩組細胞CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白測定：提取兩組細胞蛋白質(zhì)，采用Western印跡測定CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白含量，以β-actin為內(nèi)參照。Gelpre32分析軟件對各蛋白灰度值進行分析，蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1光鏡下細胞形態(tài)學變化及鑒定 光鏡下內(nèi)皮細胞邊界清楚，呈多邊形，為集落式生長(見圖1)，TGF-β1誘導48 h后，細胞間隙增大，向邊界遷移擴散，部分細胞形態(tài)變?yōu)樗笮?。?代內(nèi)皮細胞vWF相關(guān)抗原陽性率為(0.08±0.02)%。

圖1 各組內(nèi)皮細胞呈集落樣生長(DAB，×200)

2.2兩組細胞增殖和細胞遷移結(jié)果比較 TGF-β1組吸光度A值顯著低于對照組(t=24.132，P=0.000)，穿膜細胞數(shù)顯著高于對照組(t=37.745，P=0.000)。見表1。

表1 兩組細胞增殖和細胞遷移結(jié)果比較

2.3免疫熒光實驗結(jié)果 CD31和vimentin單染結(jié)果顯示：培養(yǎng)48 h后，和對照組比較，TGF-β1組間質(zhì)細胞特異性蛋白vimentin表達升高、內(nèi)皮細胞特異性蛋白CD31表達降低；雙染結(jié)果顯示：對照組含極少vimentin和CD31雙陽性細胞，而TGF-β1組vimentin和CD31雙陽性細胞明顯增多。見圖2。

圖2 細胞免疫熒光標記鑒定CD31、vimentin雙陽性的內(nèi)皮細胞(×400)

2.4兩組細胞CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白表達比較 TGF-β1組內(nèi)皮細胞特異性標志蛋白CD31和ve-cadherin明顯低于對照組，間質(zhì)細胞標志性蛋白vimentin和α-SMA明顯高于對照組(Plt;0.05)。見表2。

表2 兩組CD31、vimentin、ve-cadherin和α-SMA蛋白表達比較

3 討 論

代謝性疾病患者具有內(nèi)皮功能不全的特點，內(nèi)皮功能不全人群心房顫動的發(fā)生率增加〔5，6〕，研究發(fā)現(xiàn)代謝綜合征患者和正常人群相比心房顫動的發(fā)生率高，和非糖尿病患者比較，糖尿病患者心房顫動的發(fā)生率增加〔7〕。心功能越差內(nèi)皮功能不全越明顯，心房顫動的發(fā)生率隨著心功能的惡化而逐漸升高，他汀類藥物具有改善內(nèi)皮功能的作用，有心房顫動病史的陣發(fā)性心房顫動、心臟外科手術(shù)、急性冠脈綜合征的患者給予他汀類藥物治療可降低心房顫動的發(fā)生風險〔8〕。正常情況下，血液中很少有內(nèi)皮細胞脫落，當內(nèi)皮收到損傷時內(nèi)皮細胞脫落下來，使血液中內(nèi)皮細胞數(shù)量增加，vWF為內(nèi)皮損傷和功能障礙標志物，在心房顫動患者左心耳中的表達增加〔9～11〕。本研究顯示老年心房顫動患者存在內(nèi)皮細胞損傷，細胞間通過一系列機制互相激活、損傷，使vWF、E-選擇素、細胞間黏附分子(ICAM)-1表達增加，使大量血小板和白細胞黏附在血管內(nèi)皮，形成惡性循環(huán)。

炎癥反應和心房纖維化在心房顫動的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，TGF-β1作為多效性炎性因子，參與心房纖維化過程，TGF-β1在生理性和病理性過度修復過程中產(chǎn)生過量細胞外基質(zhì)，從而導致纖維化的發(fā)生，是膠原蛋白和細胞外基質(zhì)沉積和合成的始動因子，可誘導肺成纖維細胞、肝成纖維細胞的遷移〔12，13〕。內(nèi)皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化和多種間質(zhì)纖維化有關(guān)的疾病有關(guān)，傳統(tǒng)觀點認為纖維化的成纖維細胞來自胚胎期間質(zhì)細胞，最近研究顯示在腎臟纖維化模型中，纖維化除了局部成纖維細胞增殖外，另一部分重要來源為內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化來的成纖維細胞，TGF-β1誘導的內(nèi)皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化在糖尿病腎臟纖維化的發(fā)展中發(fā)揮促進作用〔14〕。心內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞通過內(nèi)皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化成為房室間隔、房室墊、瓣膜的間充質(zhì)細胞，TGF-β1調(diào)節(jié)這一過程，內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為心肌成纖維細胞稱為心肌纖維化的重要環(huán)節(jié)〔15，16〕。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，促進細胞增殖和遷移?？梢?，老年心房顫動患者血清TGF-β1水平增加，從而誘導內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，啟動心房間質(zhì)纖維化，從而在心房顫動的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。改善內(nèi)皮系統(tǒng)功能，阻止TGF-β1誘導的內(nèi)皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化可預防老年心房顫動的發(fā)生。

1王延梅，陳才旺，曲德軍，等.華法林對老年心房顫動患者內(nèi)皮功能及凝血系統(tǒng)的作用〔J〕.中國臨床研究，2013；26(2)：113-5.

2van Brakel TJ，van der Krieken T，Westra SW，etal.Fibrosis and electrophysiological characteristics of the atrial appendage in patients with atrial fibrillation and structural heart disease〔J〕.J Interv Card Electrophysiol，2013；38(2)：85-93.

3Fukui A，Takahashi N，Nakada C，etal.Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin Ⅱ-mediated atrial fibrosis and fibrillation〔J〕.Circ Arrhythm Electrophysiol，2013；6(2)：402-9.

4Liu C，F(xiàn)u H，Li J，etal.Hyperglycemia aggravates atrial interstitial fibrosis，ionic remodeling and vulnerability to atrial fibrillation in diabetic rabbits〔J〕.Anadolu Kardiyol Derg，2012；12(7)：543-50.

5Polovina M，Potpara T，Giga V，etal.Impaired endothelial function in lone atrial fibrillation〔J〕.Vojnosanit Pregl，2013；70(10)：908-14.

6Jesel L，Arentz T，Herrera-Siklody C，etal.Do atrial differences in endothelial damage，leukocyte and platelet activation，or tissue factor activity contribute to chamber-specific thrombogenic status in patients with atrial fibrillation〔J〕?J Cardiovasc Electrophysiol，2014；25(3)：266-70.

7石茂靜，董 蕾，劉 浩，等.糖尿病與非糖尿病患者發(fā)生心律失常類型和危險因素分析〔J〕.中國心臟起搏與心電生理雜志，2012；26(5)：410-2.

8Fang WT，Li HJ，Zhang H，etal.The role of statin therapy in the prevention of atrial fibrillation：a meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.Br J Clin Pharmacol，2012；74(5)：744-56.

9Freynhofer MK，Gruber SC，Bruno V，etal.Prognostic value of plasma von Willebrand factor and its cleaving protease ADAMTS13 in patients with atrial fibrillation〔J〕.Int J Cardiol，2013；168(1)：317-25.

10毛 山，胡學寧.纈沙坦對中老年高血壓伴永久性房顫患者的臨床療效及內(nèi)皮、炎癥因子的影響〔J〕.海南醫(yī)學院學報，2014；20(10)：1346-8.

11Scridon A，Girerd N，Rugeri L，etal.Progressive endothelial damage revealed by multilevel von Willebrand factor plasma concentrations in atrial fibrillation patients〔J〕.Europace，2013；15(11)：1562-6.

12Krafft E，Lybaert P，Roels E，etal.Transforming growth factor beta 1 activation，storage，and signaling pathways in idiopathic pulmonary fibrosis in dogs〔J〕.J Vet Intern Med，2014；28(6)：1666-75.

13Xu L，Li LC，Zhao P，etal.Total polysaccharide of Yupingfeng protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis via inhibiting transforming growth factor-β1-mediated type Ⅰ collagen abnormal deposition in rats〔J〕.J Pharm Pharmacol，2014；66(12)：1786-95.

14Ghosh AK，Nagpal V，Covington JW，etal.Molecular basis of cardiac endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT)：differential expression of microRNAs during EndMT〔J〕.Cell Signal，2012；24(5)：1031-6.

15Nagalingam RS，Sundaresan NR，Noor M，etal.Deficiency of cardiomyocyte-specific microRNA-378 contributes to the development of cardiacfibrosis involving a transforming growth factor β (TGFβ1)-dependent paracrine mechanism〔J〕.J Biol Chem，2014；289(39)：27199-214.

16Docherty NG，Murphy M，Martin F，etal.Targeting cellular drivers and counter-regulators of hyperglycaemia-and transforming growth factor-β1-associated profibrotic responses in diabetic kidney disease〔J〕.Exp Physiol，2014；99(9)：1154-62.

〔2016-08-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R541.7+5

A

1005-9202(2017)22-5509-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.011

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2017KY164)

1 溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院醫(yī)學研究中心

江建軍(1965-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事冠心病介入治療研究。

葛衛(wèi)力(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心房顫動發(fā)病機制研究。